類囊體膜是進(jìn)行光合作用原初光能轉(zhuǎn)化的場所，包括四種重要的光合膜蛋白復(fù)合物：光系統(tǒng)(PS)I、PSII、細(xì)胞色素b6/f和ATP合酶復(fù)合物，在其中植物能夠完成捕獲光能并轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的過程[1]。利用光合膜蛋白進(jìn)行電荷分離產(chǎn)生光電流的特性，研究者將分離的類囊體膜[2]、PSI[3-4]、PSII復(fù)合物[5]、細(xì)菌反應(yīng)中心[6-7]等光合膜蛋白組裝成光電器件，為制備新型生物太陽能電池奠定了基礎(chǔ)，但這些光合膜蛋白器件的光電轉(zhuǎn)化效率很低，且穩(wěn)定性也有待提高。

LB(Langmuir-Blodgett)膜技術(shù)是獲得有序排列的光合膜蛋白單分子層的重要手段，在單分子層上蛋白復(fù)合物高度有序的結(jié)構(gòu)，保證了色素分子之間能夠進(jìn)行有效的能量傳遞，并有助于使復(fù)合物具有較高的光熱穩(wěn)定性[8]。何靳安等[9]將R-藻紅蛋白(R-PE)單分子膜通過LB技術(shù)制備在SnO2光學(xué)透明電極(OTE)上，組成的光電池能夠產(chǎn)生光生電流，具有較好的光學(xué)穩(wěn)定性。

石莼(Ulva lactuca)是一類常見的潮間帶大型海洋綠藻，已有研究表明石莼對光和溫度等環(huán)境變動(dòng)具有較強(qiáng)的耐受性[10-11]。此外，本課題組的前期研究也表明，與菠菜相比石莼的類囊體膜蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性。本研究嘗試用LB膜技術(shù)分別將菠菜和海洋綠藻石莼的類囊體膜固定在納米ZnO上，組裝成光電池，并且比較了其光電性質(zhì)，以期為開發(fā)穩(wěn)定性和效率更高的生物光電器件提供參考。

1材料與方法

1.1菠菜和石莼類囊體膜的制備

菠菜類囊體膜的分離方法按照Berthold等[12]的方法加以改進(jìn)。取新鮮菠菜葉片除去葉柄、葉脈，清洗干凈，在4℃下暗適應(yīng)放置5 h以上。在含20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，0.4 mol/L蔗糖，5 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA的緩沖液中用搗碎機(jī)搗碎葉片，并用紗布過濾，所得濾液于220g離心2 min;上清液于1 500g離心10 min;沉淀加入含20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，5 mmol/L MgCl2·6H2O，15 mmol/L NaCl的緩沖液懸浮勻漿，200g離心2 min去沉淀;上清液5 000g離心15 min，沉淀用含20 mmol/L MES pH 6.5，0.4 mol/L蔗糖，35 mmol/L NaCl的保存緩沖液懸浮勻漿，即為菠菜類囊體膜。

石莼采自青島金沙灘，將新鮮葉片清洗干凈并用蒸餾水洗兩遍，加入含20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，0.2 mol/L蔗糖，10 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA的緩沖液用搗碎機(jī)破碎，紗布過濾后所得濾液于220g離心2 min，上清液于10 000g離心10 min;沉淀用含10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)的緩沖液懸浮勻漿，250g離心2 min去沉淀;上清液12 000g離心15 min，沉淀用含20 mmol/L MES pH 6.5，0.4 mol/L蔗糖，35 mmol/L NaCl的保存緩沖液懸浮勻漿，并注意將白色淀粉部分去除，所得為石莼類囊體膜。

1.2 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析在NuPAGE 4%～12%Bis-Tris Mini Gel預(yù)制膠(Invitrogen，USA)上進(jìn)行。在樣品中加入NuPAGE LDS sample Buffer和NuPAGE Reducing Agent(Invitrogen)，70℃加熱10 min，短暫離心后上樣，每孔道上樣20μL，200 V恒電壓電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3納米ZnO的制備

把摻氟氧化錫(SnO2：F，F(xiàn)TO)導(dǎo)電玻璃(日本NSG株式會(huì)社)用超聲清洗，在玻璃上滴加1 mmol/L Zn(Ac)2·2H2O乙醇溶液后用N2吹干，反復(fù)5次，放入馬弗爐中350℃加熱20 min，再把處理好的FTO玻璃放入含25 mmol/L C6H12N4和25 mmol/L Zn(NO3)2的反應(yīng)液中在75℃恒溫振蕩器中反應(yīng)9～12 h，即可在FTO導(dǎo)電玻璃上合成ZnO納米線。

1.4納米ZnO的原子力顯微鏡和掃描電鏡表征

用Nanoscope IVa原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)(Veeco/Digital Instruments，santa Barbara，USA)和表征ZnO在FTO導(dǎo)電玻璃上的分布情況和均勻性。采用Veeco TESP型探針，操作頻率為300～350 kHz，彈性常數(shù)為20～80 N/m。

用日立S-4800冷場掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)觀察ZnO在FTO導(dǎo)電玻璃表面上的生長情況，電壓5 kV。

1.5類囊體膜LB膜的制備

參照Li等[13]的方法，以0.5 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)作為亞相，3%(V/V)乙醇-水溶液作為鋪展劑，把60μL濃度為1.5 mg/mL的類囊體膜緩慢均勻地滴入Micro Trough X LB膜分析儀(芬蘭Kibron)槽內(nèi)的亞相表面，待其在亞相表面擴(kuò)散約20 min后，壓膜速率為1 mm/min，壓縮單分子層膜至表面壓為30 mN/m，保持30 min后，用垂直提拉法將膜轉(zhuǎn)移到納米ZnO表面。在納米ZnO上沉積1、3、5層的LB膜分別用來進(jìn)行熒光發(fā)射光譜和光電性能檢測。

1.6熒光發(fā)射光譜的檢測

樣品在室溫下用FluoroMax-4熒光光譜儀(Horiba Jobin Yvon)檢測，436 nm激發(fā)，狹縫寬度2 nm，檢測波長范圍625～750 nm。

1.7光電池的組裝及光電性能的檢測

將類囊體膜LB膜的納米ZnO導(dǎo)電玻璃膜面朝上放在潔凈的水平基面上，并把鍍Pt的FTO玻璃(大連七色光太陽能科技開發(fā)有限公司)作為對電極放在上面，將具有開口的熱封膜(膜厚60μm，內(nèi)孔尺寸5 mm×5 mm)置于兩電極之間，形成一定的空間，便于滴加電解質(zhì)。把兩個(gè)玻璃片微微錯(cuò)開，各自留出一定的導(dǎo)電部分，以利于電池測試。用兩個(gè)長尾夾把電池夾住，再滴入少量電解質(zhì)溶液，由于毛細(xì)管原理，電解質(zhì)溶液很快在兩個(gè)電極之間擴(kuò)散均勻，封孔后即可進(jìn)行光電性能檢測。在本實(shí)驗(yàn)中參照Abe等[14]和Lemieux等[15]的方法，稍加改動(dòng)，以pH 7.2的PBS緩沖液作為電池中的電極緩沖液。

光電性能的檢測在美國頤光科技有限公司(Crown Tech)太陽能電池I-V特性測試系統(tǒng)IV Test Station 2000上進(jìn)行，電壓/電流控制和測量采用Keithley Model 2400 SourceMeter，在模擬太陽光(AM 1.5，100 mW/cm2)照射下測定組裝電池的I-V特征曲線。得出開路電壓Voc、短路電流Isc、最大輸出功率Pout，利用公式(1)和(2)計(jì)算電池的填充因子FF和光電轉(zhuǎn)換效率η。

其中Vmax和Imax為最大輸出功率時(shí)對應(yīng)的電壓和電流，Pin為入射光強(qiáng)。

2結(jié)果與討論

2.1類囊體膜的提取和多肽組成

與高等植物菠菜相比，海洋綠藻石莼含多糖和淀粉較多，葉綠體較小，因此在類囊體膜的制備上略有不同，收集石莼類囊體膜時(shí)所需的離心速度較高，在勻漿時(shí)需要注意將白色沉淀去除。將提取的石莼和菠菜的類囊體膜進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。石莼和菠菜類囊體膜的多肽組分相似，都包括PSI的組分PsaA/B和LHCI，以及PSII的組分即PSII反應(yīng)中心的D1、D2蛋白和內(nèi)周天線蛋白CP47、CP43和外周天線蛋白LHCII等。

圖1石莼和菠菜類囊體膜的SDS-PAGE分析

2.2納米ZnO的制備和表征

納米ZnO是一種重要的光催化材料，具有成本低廉、生物相容性較好和電子傳遞特性較高的優(yōu)點(diǎn)，因此在太陽能電池、傳感器、光電器件等方面都有廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用水熱合成法定向生長ZnO納米線并用原子力顯微鏡(AFM)和掃描電鏡(SEM)對其進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2和圖3所示。

ZnO晶核在FTO導(dǎo)電玻璃表面的分布情況和分布的粒徑范圍對納米線的生長及性能有重要的影響。圖2顯示1 mmol/L的Zn(Ac)2乙醇溶液接種5次，晶核在FTO導(dǎo)電玻璃表面分布比較均勻，粒徑的分布情況也較好，一般在20～40 nm。圖3顯示納米ZnO纖維在FTO玻璃上的生長情況，納米ZnO纖維垂直FTO向上生長，長度基本一致，形成了均勻分布的納米簇，增加了與蛋白的接觸面積，減少了電流傳遞時(shí)的電阻，從而可以提高光電池的光電轉(zhuǎn)化效率。

2.3類囊體膜在納米ZnO上的吸附及光電性質(zhì)

蛋白在固體界面上的吸附有很多形式，如果蛋白在固體界面自由吸附，往往會(huì)形成堆積或者分布不均勻，使得在光電實(shí)驗(yàn)過程中得到的結(jié)果不穩(wěn)定。因此，嘗試用LB膜技術(shù)將類囊體膜組裝在納米ZnO上，以得到有序排列的蛋白分子組裝體系。

圖2原子力顯微鏡觀察在FTO上的納米ZnO

圖3納米ZnO的掃描電子顯微鏡照片，45o側(cè)視圖

圖4不同層石莼類囊體膜LB膜在納米ZnO上的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，436 nm激發(fā)

表1不同層數(shù)類囊體膜LB膜組裝成光電池的光電性能參數(shù)

圖4是石莼類囊體膜LB膜在納米ZnO上的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，類囊體膜的最大熒光發(fā)射峰在683 nm，隨著類囊體膜在ZnO上吸附層數(shù)的增加熒光發(fā)射強(qiáng)度增大。菠菜類囊體膜的熒光發(fā)射光譜表現(xiàn)出相同的趨勢(結(jié)果未顯示)。

已有報(bào)道可以將類囊體膜組裝成不同的電化學(xué)器件，Abe等[14]通過靜電吸附將螺旋藻的類囊體膜和聚離子復(fù)合聚乙烯亞胺(PEI)組裝在金電極表面，具有光電化學(xué)活性，并且能夠被除草劑抑制。將類囊體膜包埋在白蛋白-戊二醛交聯(lián)介質(zhì)中組裝成光電池，與天然類囊體膜相比，對高溫、高pH和高光強(qiáng)脅迫條件具有更強(qiáng)的耐受性[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用LB膜技術(shù)可以將類囊體膜組裝到納米ZnO上，而且能夠產(chǎn)生光電流。由不同層數(shù)的石莼和菠菜類囊體膜LB膜在ZnO上組裝成光電池的I/V曲線如圖5、圖6所示，表1列出了各光電池的光電性能參數(shù)。類囊體膜LB膜的層數(shù)顯著影響了光電池的光電轉(zhuǎn)化效率η值，隨著層數(shù)的增加，光電轉(zhuǎn)化效率大大增加。Abe等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，用靜電吸附法得到的類囊體膜電化學(xué)器件產(chǎn)生的光電流隨著吸附層數(shù)的增加而增加。

圖5不同層數(shù)菠菜類囊體膜LB膜組裝成光電池的I-V曲線

圖6不同層數(shù)石莼類囊體膜LB膜組裝成光電池的I-V曲線

此外，海洋綠藻石莼類囊體膜組裝的光電池光電轉(zhuǎn)化效率明顯高于菠菜類囊體膜。影響光電轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，類囊體膜的光合電子傳遞活性、類囊體膜與氧化鋅的吸附作用、電子從膜到工作電極的擴(kuò)散等都可能會(huì)影響光電流的產(chǎn)生速率。已有報(bào)道表明，綠藻石莼具有與高等植物不同的熒光誘導(dǎo)特性[16]、色素組成、類囊體膜垛疊方式以及熒光發(fā)射特性[17-19]。石莼的最大熒光量子產(chǎn)額高于其他藻類，其生長速度和產(chǎn)量也高于很多種屬[20-21]。石莼類囊體膜組裝的光電池光電轉(zhuǎn)化效率較高與其類囊體膜的特性具有怎樣的關(guān)系，該機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。