摘要：以低成本的泔水油和豆粕為碳、氮源，發(fā)酵培養(yǎng)不動桿菌菌株XH-2(Acinetobacter sp.XH-2)生產(chǎn)生物表面活性劑。以表面張力及排油圈直徑為考察指標，對菌株XH-2產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件進行單因素優(yōu)化，并研究了該生物表面活性劑的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，菌株XH-2在最優(yōu)培養(yǎng)基(泔水油3%、豆粕5%、氯化鎂2%、磷酸氫二鉀6%、磷酸二氫鉀3.8%、三氯化鐵0.5%、氯化鈉2%和初始pH值6.0)中發(fā)酵培養(yǎng)2 d后，所產(chǎn)的生物表面活性劑的臨界膠束濃度為200 mg·L-1，其使發(fā)酵液的表面張力由73.01 mN·m-1降至25.25 mN·m-1，具有廣泛的溫度、pH值和鹽度適應性，初步的成分分析結(jié)果表明該生物表面活性劑可能為糖脂類。

生物表面活性劑(biosurfactants)是微生物(主要有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和酵母菌等)在代謝過程中產(chǎn)生的一類集親水基和疏水基于一體的兩親化合物，具有一定的界面活性；主要包括糖脂、磷脂、脂肽、脂肪酸、多糖-脂類復合物和中性脂等，已知的生物表面活性劑以糖脂為主。與化學表面活性劑相比，生物表面活性劑具有降低溶液表面張力、增加泡沫、低毒或無毒、可生物降解、無污染、生物相容性良好、乳化性高、表面活性高以及可引入化學法難以合成的化學基團等優(yōu)點。因此，生物表面活性劑已在石油、洗滌、醫(yī)藥、化妝品等領域得到廣泛的應用，尤其在修復被石油污染的土壤、提高原油采收率等方面。然而，通過微生物合成生物表面活性劑因受產(chǎn)量低、成本高等因素的制約，尚未能實現(xiàn)真正的商業(yè)化生產(chǎn)，尋找并利用營養(yǎng)豐富的廉價原料作為發(fā)酵基質(zhì)逐漸成為研究的熱點。開發(fā)利用工農(nóng)業(yè)廢料、非食用油、餐飲廢油生產(chǎn)生物表面活性劑，不但可緩解環(huán)境壓力，變廢為寶，還可降低生產(chǎn)成本。

作者在此以低成本的泔水油、豆粕作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源，對本實驗室篩選的不動桿菌菌株XH-2(Acinetobactersp.XH-2)產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并對菌株所產(chǎn)的生物表面活性劑的性質(zhì)及成分進行研究，擬為后續(xù)的應用開發(fā)奠定理論基礎。

1實驗

1.1培養(yǎng)基與儀器

種子培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%。

基礎培養(yǎng)基：氯化鎂2%、磷酸氫二鉀6%、磷酸二氫鉀3.8%、三氯化鐵0.5%、氯化銨5%。

振蕩培養(yǎng)箱；分光光度計；全自動表面張力儀；傅立葉變換紅外光譜儀。

1.2生物表面活性劑發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.1生物表面活性劑表面活性的測定

排油圈直徑的測定：參照Chandankere等的方法，略有改進。取一培養(yǎng)皿，加入60mL蒸餾水、5mL液體石蠟和少量蘇丹Ⅲ溶液，形成均勻的油膜。在油膜中心垂直滴加1mL離心后的發(fā)酵液上清液，油膜被擠向四周形成一個圓圈，測量其直徑。排油圈直徑與生物表面活性劑含量成正比。

表面張力的測定：將發(fā)酵液于10 000r·min-1離心20min，取上清液利用圓環(huán)法測定表面張力。

1.2.2碳源對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響

在基礎培養(yǎng)基中分別添加淀粉、乳清粉、蔗糖、葡萄糖、玉米芯、柴油、甘油、防腐油、泔水油，濃度均為2%；確定最適碳源后，設置碳源的濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%；等量接種菌株XH-2于30℃、160r·min-1條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)2d，取離心后的發(fā)酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源及其濃度。

1.2.3氮源對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響

在添加優(yōu)化碳源的基礎培養(yǎng)基中，分別以濃度為2%的蛋白胨、豆粕、酵母提取物(酵提)、硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、尿素為氮源替換原有的氯化銨；確定最適氮源后，設置氮源的濃度梯度為0.5%、1%、2%、3%、5%；等量接種菌株XH-2于30℃、160r·min-1條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)2d，取離心后的發(fā)酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源及其濃度。

1.2.4接種量對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響

取優(yōu)化碳、氮源后的基礎培養(yǎng)基，將菌株XH-2接種量(V/V，下同)分別設置為1%、2%、4%、6%、8%，在30℃、160r·min-1條件下?lián)u瓶發(fā)酵2d，取離心后的發(fā)酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2的最佳接種量。

1.2.5鹽度對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響

按4%接種量接種菌株XH-2于添加不同濃度氯化鈉的優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在30℃、160r·min-1條件下?lián)u瓶發(fā)酵2d，取離心后的發(fā)酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發(fā)酵培養(yǎng)基的最適鹽度。

1.2.6初始pH值對菌株產(chǎn)生物表面活性劑的影響

用1mol·L-1HCl溶液或1mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，使其初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在30℃、160r·min-1條件下?lián)u瓶發(fā)酵2d，取離心后的發(fā)酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH值。