1.3生物表面活性劑的特性分析

1.3.1生物表面活性劑的制備

將菌株XH-2在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)60h，經(jīng)紗布初過(guò)濾的發(fā)酵液在4℃、10 000r·min-1下離心20min，取上清液用6mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，用等體積的乙酸乙酯溶液萃取2次，合并有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，將濃縮液倒入燒杯中，待自然揮發(fā)干后即得生物表面活性劑粗品。

1.3.2生物表面活性劑對(duì)溫度、pH值和鹽度的耐受性

將生物表面活性劑粗品配制成濃度為0.3g·L-1的溶液，分別在4℃、室溫、60℃、100℃條件下處理30min，冷卻至室溫，測(cè)定其表面張力。

用1mol·L-1HCl溶液或1mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)生物表面活性劑溶液的pH值分別為2、4、6、8、10、12，均于室溫下放置12h，測(cè)定其表面張力。

加入適量氯化鈉使生物表面活性劑溶液的鹽度分別為0%、1%、3%、5%、7%、9%，均于室溫下放置12h，測(cè)定其表面張力。

1.3.3臨界膠束濃度(CMC)的測(cè)定

用蒸餾水將生物表面活性劑粗品配制成不同濃度的溶液，在室溫下測(cè)定其表面張力。根據(jù)生物表面活性劑濃度與表面張力的變化曲線圖得出臨界膠束濃度。

1.3.4生物表面活性劑成分的初步鑒定

表面活性劑的鑒定：采用亞甲基藍(lán)-氯仿實(shí)驗(yàn)。將生物表面活性劑粗品配制成濃度為0.3 g·L-1的溶液，取5 mL表面活性劑溶液，依次加入10 mL亞甲基藍(lán)和5 mL氯仿，充分混勻，靜置幾分鐘后觀察其顏色。若氯仿層顏色變深，而水層幾乎無(wú)色，表明樣品屬于陰離子型表面活性劑；若水層顏色變深，而氯仿層幾乎無(wú)色，表明樣品屬于陽(yáng)離子型表面活性劑；若兩層顏色大致相同，且水層呈乳液狀，表明樣品屬于非離子型表面活性劑。

定性分析：將生物表面活性劑粗品配制成一定濃度的溶液，用1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH值到2左右，于4℃靜置過(guò)夜，觀察現(xiàn)象。若產(chǎn)生白色沉淀，表明其為脂肽或脂蛋白類表面活性劑；若沒(méi)有白色沉淀產(chǎn)生，表明其為糖脂類表面活性劑。

紅外光譜(FTIR)分析：將生物表面活性劑粗品用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。

2結(jié)果與討論

2.1不同碳、氮源對(duì)菌株XH-2產(chǎn)生物表面活性劑的影響(圖1)

圖1碳、氮源對(duì)菌株XH-2產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖1a可知，菌株XH-2以柴油為碳源時(shí)，發(fā)酵液的排油圈直徑為0；以泔水油為碳源時(shí)，排油圈直徑最大(5.1 cm)，相對(duì)應(yīng)的表面張力最小(31.1 mN·m-1)。相較于葡萄糖、淀粉、甘油這些常用碳源，泔水油用作產(chǎn)生物表面活性劑的原料尚未見(jiàn)報(bào)道。以泔水油為原料生產(chǎn)生物表面活性劑，既能廢物利用，又節(jié)能環(huán)保，具有顯著的現(xiàn)實(shí)意義。由圖1b可知，當(dāng)泔水油濃度為3%時(shí)，表面張力最小(30.49 mN·m-1)，排油圈直徑最大(4.8 cm)。因此，確定最適碳源為3%泔水油。

由圖1c可知，以豆粕為氮源時(shí)，發(fā)酵液的表面張力最小(29.69 mN·m-1)，相對(duì)應(yīng)的排油圈直徑最大(6.1 cm)；當(dāng)采用無(wú)機(jī)氮源尿素和硫酸銨時(shí)，雖然發(fā)酵液的表面張力較小，分別為30.62 mN·m-1和30.56 mN·m-1，但相對(duì)應(yīng)的排油圈直徑也小，分別為3.75 cm和3.25 cm。已有利用無(wú)機(jī)氮源(如氯化銨、硝酸鈉等)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑的相關(guān)報(bào)道，而在本研究中最適的氮源是豆粕。由圖1d可知，隨著豆粕濃度的增大，排油圈直徑增大，在豆粕濃度為5%時(shí)，排油圈直徑達(dá)到最大(6.75 cm)，表面張力最小(25.83 mN·m-1)。因此，確定最適氮源為5%豆粕。

2.2最佳接種量、鹽度、初始pH值的確定(圖2)

接種量影響微生物所產(chǎn)生物表面活性劑的產(chǎn)量。接種量過(guò)大，培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高，過(guò)量的菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中因消耗大量的營(yíng)養(yǎng)底物而使生物表面活性劑的產(chǎn)量降低；接種量過(guò)小，培養(yǎng)液中菌體濃度低，培養(yǎng)周期延長(zhǎng)。由圖2a可知，在接種量為4%時(shí)，表面張力最小(30.39 mN·m-1)，相對(duì)應(yīng)的排油圈直徑最大(5.25 cm)；接種量超過(guò)4%后，表面張力增大。因此，確定最佳接種量為4%。

圖2接種量(a)、鹽度(b)和初始pH值(c)對(duì)菌株XH-2產(chǎn)生物表面活性劑的影響

鹽度調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，影響微生物的新陳代謝和酶的活性，鹽度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)微生物的新陳代謝產(chǎn)生不利影響。由圖2b可知，鹽度為2%時(shí)，表面張力最小(25.75 mN·m-1)，排油圈直徑最大(7.25 cm)；而鹽度低于或高于2%時(shí)，發(fā)酵液的表面張力增大，排油圈直徑減小。因此，確定菌株XH-2產(chǎn)生物表面活性劑的最適鹽度為2%。

微生物的生命代謝活動(dòng)與環(huán)境的pH值密切相關(guān)。微生物機(jī)體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)一般是酶促反應(yīng)，參與反應(yīng)的酶都有其相應(yīng)的最適pH值范圍，一般認(rèn)為pH值6.5～8.5有利于微生物產(chǎn)生物表面活性劑。由圖2c可知，菌株XH-2在初始pH值5.0～10.0范圍內(nèi)，其表面張力基本上是先減小后增大。當(dāng)初始pH值為6.0時(shí)，發(fā)酵液的排油圈直徑最大(7.1 cm)，表面張力最小(25.25 mN·m-1)；當(dāng)初始pH值為10.0時(shí)，發(fā)酵液的排油圈直徑最小(5.2 cm)，表面張力為26.91 mN·m-1。因此，確定菌株XH-2產(chǎn)生物表面活性劑發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH值為6.0。