2結(jié)果與分析

2.1 Protamex酶水解對(duì)玉米谷蛋白泡沫性質(zhì)的影響

由圖1可知，經(jīng)Protamex酶水解的玉米谷蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均顯著高于原玉米谷蛋白（起泡性（124.46±3.85）%、泡沫穩(wěn)定性（102.96±3.51）%，P＜0.05），且隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，呈先增加后減小的變化趨勢(shì)。在水解120 min時(shí)，水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都為最高，即（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，分別是原玉米谷蛋白的2.8倍和2.2倍左右。Patino和Ren等水解向日葵蛋白分離物時(shí)得到了相似的結(jié)果，水解可以提高蛋白質(zhì)的起泡力和泡沫穩(wěn)定性，但過(guò)度水解對(duì)其起泡性和泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生了不利影響。

圖1水解時(shí)間對(duì)玉米谷蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

圖2a、b分別為玉米谷蛋白及其水解物經(jīng)攪打產(chǎn)生泡沫的宏觀和微觀圖像。玉米谷蛋白分散液中懸浮有明顯的大顆粒，產(chǎn)生的泡沫量少且稀疏、形狀不規(guī)則，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)泡沫幾乎消失。微觀形貌顯示玉米谷蛋白膜在泡沫形成10 min時(shí)已經(jīng)發(fā)生崩塌。玉米谷蛋白經(jīng)過(guò)Protamex酶水解后，其水解物的溶解性顯著增加（P＜0.05）（表1），因此在泡沫中未見(jiàn)明顯顆粒，泡沫量明顯增加且較為綿密，微觀形貌顯示氣泡數(shù)量增多、近似圓形且大小趨于一致、平均氣泡面積變小，分布致密有序。水解120 min樣品所形成的泡沫最細(xì)小均勻，且在泡沫形成后的30 min內(nèi)，與其他水解時(shí)間的樣品相比，其氣泡數(shù)量最多，平均氣泡面積最小，蛋白膜的厚度較厚。有報(bào)道稱平均氣泡面積越小，分布越均勻致密越有利于其穩(wěn)定。但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都顯著降低（P＜0.05）。蛋白質(zhì)的起泡性與蛋白質(zhì)溶解性、分子尺寸、疏水性和分子柔性等性質(zhì)有關(guān)，泡沫穩(wěn)定性則由蛋白質(zhì)的黏度、膜的厚度、分子間相互作用等性質(zhì)決定。因此，通過(guò)對(duì)以上性質(zhì)的研究解析水解后玉米谷蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的變化原因。

表1水解時(shí)間對(duì)玉米谷蛋白溶解性、水解度、表面張力和表面疏水性的影響

注：同列肩標(biāo)小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

圖2不同水解時(shí)間玉米谷蛋白泡沫的宏觀圖像（a）和微觀圖像（b）

2.2 Protamex酶水解對(duì)玉米谷蛋白溶解性和表面張力的影響

由表1可知，原玉米谷蛋白的溶解性僅為（20.90±0.17）%，經(jīng)Protamex酶水解后，水解物的溶解性顯著提高，在水解60 min后均可達(dá)到90%以上。這說(shuō)明Protamex酶水解能夠改善谷蛋白的溶解性，其水解物中蛋白質(zhì)/多肽能夠更好地分散在水中，形成膠體態(tài)溶液。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)水解物分散液并非透明澄清的溶液，而是可以看到少量膠體物質(zhì)懸浮于溶液中，并且在溶解性測(cè)定方法的離心力下，這些懸浮的蛋白質(zhì)也不能夠完全被沉淀，而是較穩(wěn)定的存在于上清液中。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液被攪打時(shí)，只有分散在溶液中的蛋白質(zhì)才能夠快速在氣/水界面吸附。因此，水解物溶解性的提高使可以吸附到氣/水界面上的蛋白質(zhì)含量增加，這對(duì)玉米谷蛋白起泡力的改善具有積極意義。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米谷蛋白的水解度在反應(yīng)前30 min中快速增加，之后持續(xù)升高并在120 min后趨于平穩(wěn)，所有水解物的蛋白質(zhì)含量在74%～85%之間。原玉米谷蛋白的表面張力為（71.83±0.50）mN/m，經(jīng)Protamex酶水解后，其水解物的表面張力均顯著降低，且隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降低后升高趨勢(shì)。當(dāng)水解時(shí)間在120 min時(shí)表面張力達(dá)最低（60.40±0.72）mN/m，這與其起泡性的變化趨勢(shì)一致。這是由于適度的水解有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)的分子柔性，暴露出更多疏水基團(tuán)，更有利于水解物中蛋白質(zhì)/多肽的疏水性基團(tuán)和親水性基團(tuán)分別伸展至氣相和水相，從而在界面處發(fā)生吸附，導(dǎo)致表面張力的降低。表面張力反映蛋白質(zhì)分子在氣/水界面的吸附和展開(kāi)的速度。表面張力越低，蛋白能夠越快速的完成在氣水界面上的吸附，形成有一定黏彈性的保護(hù)層，促進(jìn)泡沫的形成以及維持泡沫體系的穩(wěn)定。過(guò)度的水解使蛋白質(zhì)分子持續(xù)減小，低分子質(zhì)量多肽由于肽段過(guò)短而失去分子柔性，不能在界面處發(fā)生吸附，導(dǎo)致水解時(shí)間為150 min水解物的表面張力增加。

2.3 Protamex酶水解對(duì)玉米谷蛋白粒徑分布及Zeta電位的影響

蛋白質(zhì)受到酶和熱的作用，使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生解離和聚集的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)測(cè)量粒徑及Zeta電位可對(duì)其水解過(guò)程中蛋白質(zhì)分子大小、聚集和靜電相互作用情況進(jìn)行表征。由圖3a可知，玉米谷蛋白的粒徑分布圖中出現(xiàn)3個(gè)明顯粒徑峰，P1（＜68 nm）、P2（68～825、900 nm）和P3（＞3 000 nm）。隨著Protamex酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解物的粒徑逐漸向小粒徑方向移動(dòng)，其中P2峰逐漸向左移動(dòng)與P1峰重合，在水解60 min后的酶解物中P1峰完全消失，同時(shí)粒徑較大的P3峰也在水解60 min后消失。這說(shuō)明著Protamex酶水解作用不僅使玉米谷蛋白的粒徑降低，同時(shí)使粒徑均一度增加。由圖3b可知，水解30 min后酶解物平均粒徑顯著降低（P＜0.05），并隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)降低。這可能是由于水解作用切斷了玉米谷蛋白分子內(nèi)肽鍵，大分子質(zhì)量聚集體發(fā)生降解，低分子質(zhì)量二聚體/亞基或者多肽逐步釋放，使粒徑降低。而水解反應(yīng)過(guò)程中水熱環(huán)境的作用可能引起暴露巰基的氧化交聯(lián)等共價(jià)作用使部分蛋白質(zhì)/多肽發(fā)生聚集，因此水解60 min和120 min樣品的平均粒徑差異不顯著（P＞0.05）。楊曉釩等在酶水解處理扁桃仁蛋白質(zhì)的研究中也發(fā)現(xiàn)了水解時(shí)間超過(guò)60 min后，水解物的粒徑反而逐漸增大。值得注意的是，本研究采用馬爾文納米激光粒度儀測(cè)定的樣品粒徑為納米級(jí)別，對(duì)玉米谷蛋白中部分粒徑較大的大分子質(zhì)量天然聚集體未能測(cè)出。

圖3水解時(shí)間對(duì)玉米谷蛋白的粒徑分布（a）和平均粒徑及Zeta電位（b）的影響

由圖3b可以看出，與原谷蛋白相比，Protamex酶水解物的Zeta電位絕對(duì)值顯著降低（P＜0.05），在水解120 min時(shí)達(dá)到最低，為（16.30±0.50）mV，而酶解150 min時(shí)回升至（19.47±0.31）mV。玉米谷蛋白的Zeta電位為負(fù)值，說(shuō)明其分子表面帶有負(fù)電荷，絕對(duì)值降低說(shuō)明了水解蛋白質(zhì)分子表面凈電荷減少。這是由于水解過(guò)程中脫氨基作用和帶正電荷氨基酸暴露，使得蛋白質(zhì)/多肽所帶正電荷增加，從而中和部分負(fù)電荷所致。當(dāng)水解時(shí)間延長(zhǎng)至150 min，可能是由于反應(yīng)進(jìn)程中蛋白質(zhì)/多肽的解聚與聚集動(dòng)態(tài)變化導(dǎo)致部分帶正電荷氨基酸重新被包埋而使絕對(duì)值增加，也可能是帶負(fù)電荷氨基酸暴露增加所致。表面凈電荷的減少對(duì)蛋白質(zhì)/多肽在膜界面的吸附和擴(kuò)散有利，促進(jìn)泡沫的形成。同時(shí)還能夠降低它們?cè)诮缑娴撵o電斥力，有利于形成黏彈性較好的界面膜而增強(qiáng)泡沫穩(wěn)定性。Xiong Wenfei等研究也指出較小的粒徑與表面電荷可加速蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散速度，提升其在氣/水界面的吸附速率，并有利于蛋白質(zhì)分子在界面上的展開(kāi)和重排，從而提高起泡性。

2.4 Protamex酶水解對(duì)玉米谷蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

玉米谷蛋白中的芳香族氨基酸，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基在激發(fā)波長(zhǎng)290 nm處可產(chǎn)生熒光，即內(nèi)源性熒光。內(nèi)源熒光光譜變化反映了谷蛋白及其水解物中芳香族氨基酸所處的微環(huán)境極性的變化情況，是對(duì)Protamex酶水解過(guò)程中蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的表征。由圖4可知，與原玉米谷蛋白相比，Protamex酶水解物的內(nèi)源性熒光光譜峰位發(fā)生明顯的紅移現(xiàn)象，且內(nèi)源性熒光強(qiáng)度水解時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)。這表明水解使玉米谷蛋白的芳香族氨基酸特別是色氨酸的極性環(huán)境增強(qiáng)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展。Zheng Zhaojun等通過(guò)Bromelain和Alcalase分別水解黑豆蛋白時(shí)也獲得了相似結(jié)果，水解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度均高于原蛋白樣品。Protamex屬于絲氨酸蛋白酶，酶水解過(guò)程中以絲氨酸殘基作為活性中心主要促使玉米谷蛋白中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸等的羧基端多肽鏈裂解，導(dǎo)致芳香族氨基酸殘基和疏水性氨基酸的暴露，增強(qiáng)了玉米谷蛋白的分子柔性，這有利于玉米谷蛋白質(zhì)能發(fā)揮良好的起泡力和泡沫穩(wěn)定性。但是在水解150 min盡管有更多的芳香族氨基酸殘基暴露，卻不能使水解物的起泡力和泡沫穩(wěn)定性持續(xù)增加，這是因?yàn)橛绊懹衩坠鹊鞍姿馕锲鹋菪再|(zhì)變化是多種因素相互作用的結(jié)果。

圖4水解時(shí)間對(duì)玉米谷蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響