3討論

近年來，針對分枝桿菌的研究以宿主導(dǎo)向治療（HDT）為核心的免疫治療策略為主。HDT不僅可以對耐藥菌和敏感菌治療有效，而且避免了細菌耐藥性的產(chǎn)生，可以縮短抗生素治療周期。COSTA等建議將HO-1作為HDT治療結(jié)核病的潛在靶點。說明HO-1具有潛在的治療價值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HO-1過表達能夠有效抑制M.abs誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3Ⅱ表達，p62表達增加，對溶酶體熒光值影響較小。抑制HO-1酶活性能有效增強ATG5、LC3Ⅱ表達，p62表達減少，溶酶體熒光值增加。說明抑制HO-1能有效增強自噬流的發(fā)生，有利于清除細胞內(nèi)M.abs。

HO-1表達變化對胞內(nèi)菌生長具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)M.abs在感染過程中HO-1蛋白表達先增加，隨著感染復(fù)數(shù)增加或感染時間延長，HO-1蛋白表達有下降趨勢。一方面，M.abs感染早期，HO-1表達增加有助于M.abs胞內(nèi)增殖，可能與HO-1催化產(chǎn)物亞鐵離子為細菌生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，或者可能與HO-1表達增加抑制了細胞凋亡，為細菌胞內(nèi)存活提供有利環(huán)境有關(guān)。此外，HO-1過表達產(chǎn)生大量游離亞鐵離子可引起鐵死亡，導(dǎo)致分枝桿菌在細胞中傳播。由此可見，HO-1表達增加不利于宿主對胞內(nèi)菌的清除。另一方面，隨著M.abs感染時間的延長，HO-1蛋白表達有降低趨勢，可能與M.abs感染后期，宿主抑制HO-1表達，增強自身自噬活性，清除胞內(nèi)M.abs及減輕細胞炎癥反應(yīng)有關(guān)。

自噬增強對病原體胞內(nèi)清除具有重要的作用。自噬參與固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，是機體清除自身有害的成分，維持自身穩(wěn)態(tài)的一種調(diào)節(jié)方式。近年來，有文獻報道自噬增強可以有效控制胞內(nèi)病原體，并且已有自噬選擇性治療藥物相關(guān)報道。一般情況下，p62被認為是自噬流的標志物，其通過與LC3相互作用錨定于吞噬體上，并在自噬活化過程中通過自噬溶酶體途徑不斷被降解。因此，p62表達量反映了自噬活化強弱。自噬相關(guān)蛋白Atg5是LC3Ⅰ向LC3Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)換以及使LC3Ⅱ蛋白錨定于自噬體的關(guān)鍵蛋白。Atg5減少說明其轉(zhuǎn)化作用受抑制，從而使LC3Ⅱ表達減少，自噬體形成減少，p62體內(nèi)聚集，抑制自噬。這說明Atg5是控制自噬強弱的關(guān)鍵蛋白，它可影響整個自噬功能的結(jié)局。本研究結(jié)果揭示，M.abs誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3Ⅱ增加，說明M.abs可誘導(dǎo)自噬小體形成，然而p62并沒有減少，反而增多，說明M.abs抑制自噬溶酶體降解，阻斷了M.abs胞內(nèi)清除，與KIM等的研究結(jié)果相似。此外，自噬流標志物p62和HO-1之間有密切的聯(lián)系。KATSURAGI等研究發(fā)現(xiàn)p62磷酸化可增強p62與Keap1之間的親和力，促使Nrf2與Keap1復(fù)合物分離并轉(zhuǎn)入細胞核，導(dǎo)致Nrf2相關(guān)性抗氧化蛋白HO-1的表達增加，p62與Keap1隨后通過自噬途徑被降解。本研究發(fā)現(xiàn)HO-1誘導(dǎo)劑CoPP預(yù)處理后，HO-1和p62表達顯著升高，HO-1表達增加可能與p62與Nrf2競爭性結(jié)合Keap1，促使Nrf2入核誘導(dǎo)HO-1表達有關(guān)，但本研究沒有發(fā)現(xiàn)p62表達減少現(xiàn)象，可能與自噬被抑制有關(guān)。此外，本研究通過采用HO-1誘導(dǎo)劑CoPP和酶抑制劑SnPP預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，HO-1有效調(diào)控Atg5表達，對p62和LC3Ⅱ表達結(jié)果與KIM等采用Atg5 siRNA干擾結(jié)果一致。因此，本研究結(jié)果說明HO-1至少可以通過調(diào)節(jié)Atg5進行自噬小體調(diào)控。進一步用LysoTracker Red染色發(fā)現(xiàn)SnPP抑制HO-1能顯著增加細胞溶酶體酸性區(qū)室熒光。采用早期自噬抑制劑3-MA和晚期自噬抑制劑BafA1均顯著減少溶酶體紅色熒光，說明抑制HO-1能動員更多溶酶體參與自噬活化。

值得一提的是，本研究胞內(nèi)菌落計數(shù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CoPP預(yù)處理組與單獨M.abs組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SnPP預(yù)處理細胞3 h后加入M.abs共孵育24 h，菌落計數(shù)沒有明顯減少。然而SnPP預(yù)處理細胞12 h后加入M.abs共孵育48 h，顯著抑制胞內(nèi)細菌生長和細胞因子TNF-α表達。TNF-α表達結(jié)果與SCHARN等研究結(jié)果相似，可能與自噬增強清除病原菌導(dǎo)致炎癥減輕有關(guān)。一般而言，炎癥、自噬和細菌胞內(nèi)存活三者之間有著密切的聯(lián)系。胞內(nèi)細菌能導(dǎo)致自噬增強和炎癥產(chǎn)生，而自噬精準調(diào)控病原體引起的炎癥反應(yīng)，主要有以下3種形式：①自噬通過清除病原體，進而抑制炎癥反應(yīng)；②自噬可以降解炎癥小體調(diào)控炎癥或直接下調(diào)炎癥因子；③自噬能夠通過調(diào)控免疫細胞的細胞器功能間接調(diào)控炎癥因子產(chǎn)生。因此，自噬對病原體及炎癥的調(diào)節(jié)起到重要的作用。研究抑制HO-1為靶標的藥物可能對抑制M.abs胞內(nèi)活性具有潛在的臨床應(yīng)用價值。已有文獻報道非編碼單鏈RNA分子模擬物通過抑制HO-1表達實現(xiàn)炎癥調(diào)節(jié)和胞內(nèi)菌清除。下一步，本研究將通過數(shù)據(jù)庫對以HO-1為靶點進行microRNA預(yù)測并篩選，為將來靶向藥物的臨床試驗提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HO-1有效調(diào)控M.abs誘導(dǎo)的自噬流發(fā)生，并且HO-1抑制劑SnPP通過增強細胞自噬活性，有效抑制M.abs胞內(nèi)存活及炎癥反應(yīng)。為下階段以抑制HO-1為靶向的免疫治療藥物篩查提供科學(xué)的理論依據(jù)。