摘要：通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了肥皂莢皂苷的水浸提工藝，分析了皂苷的表面活性性能，并對(duì)皂苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步表征，結(jié)果表明:肥皂莢皂苷水浸提的最佳工藝條件為2.0 g肥皂莢果皮粉末，提取溫度69℃，提取時(shí)間11 h 15 min，液料比10∶1(mL∶g)，在此條件下，皂苷得率達(dá)26.49%。經(jīng)過大孔吸附樹脂純化后得到60%乙醇洗脫皂苷和90%乙醇洗脫皂苷，其最低表面張力分別為47.43和35.83 mN/m，臨界膠束濃度分別為0.35和0.75 g/L，皂苷中總糖分別為58.46%和51.16%。2種皂苷中單糖均為葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖等，但單糖含量略有差異。紫外和紅外光譜分析表明:2種肥皂莢皂苷樣品的紫外最大吸收波長(zhǎng)均為470 nm左右，且均具有皂苷的基本紅外特征。

肥皂莢(Gymnocladus chinensis)，為豆科肥皂莢屬落葉喬木，廣泛分布于中國(guó)各地如江蘇、浙江、江西、安徽、福建、湖北、湖南等。肥皂莢果皮中含有豐富的皂苷，屬于天然環(huán)境友好型的表面活性劑，目前仍沒有得到充分開發(fā)利用。目前關(guān)于肥皂莢皂苷提取工藝的研究較少，僅有關(guān)于肥皂莢種皮中提取得到的皂苷結(jié)構(gòu)的研究及其在藥物方面應(yīng)用的探究，具體表現(xiàn)為其在抑制酶活性和抗增殖活性等方面有一定的作用。皂苷的提取工藝主要有有機(jī)溶劑提取、超臨界CO2提取和水浸提3種方式。有機(jī)溶劑提取不僅操作繁瑣，而且污染環(huán)境；超臨界CO2提取對(duì)設(shè)備要求較高，會(huì)增加提取成本；而水浸漬法提取皂苷具有操作簡(jiǎn)單、安全可靠、成本低和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究以肥皂莢果皮為原料，采用水浸提的方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化肥皂莢皂苷的提取工藝；并對(duì)純化后得到的皂苷進(jìn)行性能分析和初步的結(jié)構(gòu)表征，以期為肥皂莢資源的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1原料、試劑與儀器

肥皂莢果皮，采集于湖北省，干燥、粉粹、過篩，選取粒徑≤0.250 mm部分，存放于干燥器中備用；香草醛、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸、α-萘酚、溴化鉀、鹽酸、石油醚(沸程60~90℃)，均為分析純?cè)噭?北京化工試劑廠)；AB-8型大孔吸附樹脂；葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，美國(guó)SIGMA公司；純凈水等。

UV-6100A紫外-可見分光光度計(jì)，上海比朗儀器有限公司；Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，Bruker公司；Waters 2695高效液相色譜(配備Aminex HPX-87P柱子和2414 RID示差折光檢測(cè)器)，Waters公司；Delta-8全自動(dòng)高通量表面張力儀，芬蘭Kibron公司。

1.2肥皂莢皂苷的提取

1.2.1工藝流程

準(zhǔn)確稱取2.0 g肥皂莢果皮粉末，按照一定液料比與蒸餾水混勻于具塞錐形瓶中，置于預(yù)設(shè)好的振動(dòng)頻率110 r/min的搖床中，在一定的溫度下提取一定的時(shí)間，結(jié)束后將提取液放置于離心管中，4 000 r/min離心20 min，得到的上清液為粗皂苷水溶液。

1.2.2工藝優(yōu)化

分別選取不同提取溫度(25、35、45、55、65、75和85℃)、提取時(shí)間(8、12、16、20和24 h)、液料比(5:1、8:1、10:1、12:1、15:1和20:1，mL:g，下同)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，計(jì)算皂苷得率，比較不同條件對(duì)肥皂莢皂苷得率的影響。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)和液料比(C)為考察因素，皂苷得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化肥皂莢皂苷提取工藝。

1.2.3皂苷得率的測(cè)定

參考香草醛-濃硫酸法使用自制的肥皂莢皂苷標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱量1.0 g自制肥皂莢皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶于水中，配置1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.25、0.30、0.35和0.40 mL，置于10 mL具塞試管中，滴加去離子水至0.5 mL以配置成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再滴加0.5 mL的80 g/L的香草醛溶液，于冰水浴中滴加4 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)77%的濃硫酸，搖勻后置于60℃的恒溫水浴鍋中15 min，再移至冰水浴中放置10 min，在最大吸收波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程為：Y=0.947 2X+0.000 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。

取1.2.1節(jié)中得到的粗皂苷水溶液0.5 mL，分別加入0.5 mL的80 g/L的香草醛溶液和4 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)77%的濃硫酸，搖勻后于60℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min，再置于冰水浴中靜置10 min，再在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算皂苷的質(zhì)量濃度。根據(jù)下式計(jì)算皂苷得率(y)：

式中：C—粗皂苷水溶液中皂苷的質(zhì)量濃度，g/L；V—粗皂苷溶液的體積，L；m—原料質(zhì)量，g。

1.3肥皂莢皂苷的純化

粗皂苷水溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥得到粗皂苷粉末。配置30 g/L的粗皂苷水溶液，通過已經(jīng)處理好的大孔吸附樹脂上樣，吸附完成后，用水進(jìn)行洗滌至無游離糖存在。前期研究表明AB-8大孔樹脂對(duì)皂苷類化合物有較好的吸附性能，因此本研究采用AB-8樹脂進(jìn)行純化。最后使用30%、60%和90%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，得到60%和90%乙醇洗脫這2種皂苷樣品(30%的乙醇洗脫液中并未檢測(cè)到皂苷的存在)。

1.4皂苷的性能表征

1.4.1表面張力的測(cè)定

取適量的干燥后的60%和90%乙醇洗脫的2種皂苷樣品，配置成一系列濃度梯度的皂苷水溶液，在30℃下采用Delta-8全自動(dòng)高通量表面張力儀測(cè)定各濃度樣品的表面張力。

1.4.2臨界膠束濃度的確定

根據(jù)1.4.1節(jié)得到的2種皂苷的表面張力，取濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，表面張力為縱坐標(biāo)，由圖判斷表面張力不再有明顯下降所對(duì)應(yīng)的最低濃度為臨界膠束濃度。

1.5皂苷的結(jié)構(gòu)表征

1.5.1紫外和紅外光譜分析

將1.3節(jié)純化得到的2種皂苷樣品取適量配成水溶液，采用UV-6100A紫外-可見分光光度計(jì)，采用香草醛-濃硫酸法，在400~900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。采用Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀，對(duì)絕干后的2種皂苷樣品采用KBr壓片法，在波數(shù)為400~4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.5.2高效液相色譜(HLPC)分析

將2種皂苷樣品分別放入具塞耐壓瓶中，加入適量1 mol/L稀鹽酸，于100℃水解1 h。冷卻至室溫后用NaOH中和至pH值為3~4，4 000 r/min離心10 min。取上清液用0.22μm濾膜過濾，HPLC測(cè)定。采用美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定皂苷樣品中單糖成分，HPLC配置示差折光檢測(cè)器(35℃)，在65℃條件下使用Aminex HPX-87H柱，流動(dòng)相為0.5 mL/min的0.005 mol/L H2SO4。