3、結(jié)果

3.1.精漿的界面性質(zhì)

精漿SDS-PAGE電泳顯示存在一系列不同比例的14至120 kDa的多肽（圖1），與先前的研究結(jié)果一致[37]。在車道4上估計(jì)了14至30 kDa之間的五個(gè)主要波段的比例。

圖1。從牛射精中分離并以不同濃度沉積的精漿SDS-PAGE凝膠：lane 1:1g；車道2:2g；車道3:5g和車道4:10g。

在大約16–17 kDa（74%強(qiáng)度）處發(fā)現(xiàn)了兩條非常緊密和強(qiáng)烈的條帶。它們被歸因于BSP1和BSP3[12]。在大約28 kDa（9%）處檢測(cè)到第二條帶，對(duì)應(yīng)于BSP5[12]。BSP1、BSP3和BSP5代表精漿中所含最小多肽的83%（在整個(gè)提取物中約占65%）[17]。另一條帶在22kDa（4%）處檢測(cè)到，另一條帶在14kDa（13%）處檢測(cè)到，對(duì)應(yīng)于核糖核酸酶[22]。

圖2。牛精漿溶液在空氣-水界面的表面張力（±標(biāo)準(zhǔn)偏差），與提取物中所含蛋白質(zhì)的濃度有關(guān)，并以對(duì)數(shù)標(biāo)度表示（T=23.2?C±0.3?C、n=2，每個(gè)樣品重復(fù)4次）。

通過(guò)跟蹤精漿水溶液（圖2）的表面張力與濃度（吉布斯膜）的關(guān)系，突出了組分。新樣品的表面張力相對(duì)較低（47 mN/m），并隨著樣品的稀釋而增加。在1/100000的大稀釋后，表面張力值等于純緩沖-空氣界面（72 mN/m）的值。因此，精漿顯示出顯著的表面活性：首先，新鮮樣品（47 mN/m）的表面張力與已知表面活性蛋白（如牛血清白蛋白[38]或溶菌酶[39]）的值一樣低，其次，表面活性仍然存在于較大的濃度范圍內(nèi)（需要稀釋100000以去除表面活性）。此外，通過(guò)朗繆爾薄膜分析了空氣-緩沖界面處表面薄膜的穩(wěn)定性。薄膜（）的壓縮等溫線顯示壓力在兩個(gè)步驟中從0顯著增加到35 mN/m。在18.9 mN/m時(shí)，出現(xiàn)斜率斷裂，這與空氣-緩沖界面分子構(gòu)象的變化有關(guān)。在較高壓力下壓縮膜的能力（大約與生物膜相關(guān)的壓力，25 mN/m）表明，由精漿成分形成的膜具有較高的穩(wěn)定性。

通過(guò)傳播精漿在空氣/緩沖液界面形成的單層的表面壓力面積（?–A）等溫線（n=3，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0-18.9 mN/m范圍內(nèi)不超過(guò)1.5 mN/m，在18.9-38 mN/m范圍內(nèi)不超過(guò)1.2 mN/m）。

3.2.低密度脂蛋白和脂質(zhì)體對(duì)精子膜仿生外小葉的作用

將低密度脂蛋白和脂質(zhì)體引入精子膜仿生外小葉亞期的影響如圖4所示。對(duì)于控制測(cè)量（未注入任何保護(hù)劑，設(shè)計(jì)為圖4中的M），表面積隨時(shí)間略微減小。當(dāng)?shù)兔芏戎鞍妆蛔⑸涞街亟ǖ耐庑∪~下方的亞相（圖4中的曲線M/LDL）時(shí)，它導(dǎo)致表面積快速而大的增加。相反，與參考單層（曲線M）相比，脂質(zhì)體的注射（圖4中的曲線M/C4）幾乎沒(méi)有改變單層的膜壓力。脂質(zhì)體與單層脂質(zhì)體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)比低密度脂蛋白慢得多。因此，在與精液制備相對(duì)應(yīng)的時(shí)間尺度上，脂質(zhì)體在空氣-水界面上的吸附較弱。

圖4。單層（M）所覆蓋的界面的相對(duì)表面積隨時(shí)間的變化，該單層（M）以25 mN/M的速度壓縮，并在不含任何額外分子（-）的緩沖液上形成，（…）LDL（4.6 mg PC）和（-）脂質(zhì)體C4（含4.8 mg PC）。氣溫是34度?C在空氣-緩沖器接口處。

對(duì)于低密度脂蛋白，根據(jù)低密度脂蛋白的組成，注射磷脂酰膽堿的量估計(jì)為4.6毫克[33]。就脂質(zhì)體而言，該分散體含有6.55±0.02 mg脂質(zhì)，即4.8 mg磷脂酰膽堿。在重建的精子膜外小葉下注射低密度脂蛋白后，表面積的大幅增加可能與低密度脂蛋白在空氣-水界面自發(fā)吸附和擴(kuò)散的能力有關(guān)[33]。低密度脂蛋白在界面處的容易破壞可能釋放出磷脂和蛋白質(zhì)，這些磷脂和蛋白質(zhì)是表面活性物質(zhì)，而甘油三酯是不可溶的[33]。對(duì)于脂質(zhì)體，形成雙層磷脂和形成單層磷脂之間的平衡取決于鏈不飽和度、鏈長(zhǎng)和極性頭基[40]?？紤]到雞蛋卵磷脂（PC 74%）的主要成分及其脂肪酸組成[41]，飽和PC和不飽和PC的比例分別約為48%和52%。在本研究的溫度下，飽和PC未熔化，可能不會(huì)在界面擴(kuò)散，而不飽和PC遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其熔化溫度，并可能擴(kuò)散。在剩余的部分PE（11%）中，形成磷脂的雙層和單層之間的平衡與磷脂的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此不能對(duì)它們給出任何結(jié)論。因此，沒(méi)有基本的解釋。雞蛋脂質(zhì)體缺乏吸附可以解釋為其擴(kuò)散之前已在自由界面上進(jìn)行過(guò)檢查：界面上已經(jīng)存在的單層可能會(huì)限制磷脂基脂質(zhì)體的擴(kuò)散，而磷脂基脂質(zhì)體在其他地方被認(rèn)為是高穩(wěn)定性的散裝物，尤其是由磷脂酰膽堿組成時(shí)。

3.3.低密度脂蛋白和脂質(zhì)體分離精漿成分

將牛精漿（SP）注射到單層下方時(shí)，監(jiān)測(cè)分子面積隨時(shí)間的變化（圖5中的曲線M/SP）。由于脂質(zhì)覆蓋了界面，表面積并沒(méi)有立即增加，而是在150s后才增加。它在150秒內(nèi)達(dá)到最大值（注射后300秒），然后穩(wěn)定300秒并隨時(shí)間緩慢下降（圖5）。表面積的快速增加表明SP組分（很可能是蛋白質(zhì)）具有良好的表面活性，如圖所示。2和3。600秒后，比表面積的減小速度與純單分子膜相同。因此，BSP蛋白一旦被吸附，就會(huì)留在界面上。

圖5。注入（…）后，由單層（M）覆蓋并在不含（-）額外分子的緩沖液上形成的界面的相對(duì)表面積隨時(shí)間的變化SP（26.6±1.5 mg蛋白質(zhì)）、SP（26.6±1.5 mg蛋白質(zhì)）和不同濃度（··-）C1、（·-）C2的脂質(zhì)體的混合物，（·-）C3和（·-）C4（分別為1.17±0.02 mg、2.18±0.02 mg、4.37±0.02 mg和6.55±0.02 mg脂質(zhì)）和（－－－）LDL（4.6 mg PC）和SP（26.6±1.5 mg蛋白質(zhì)）的混合物。氣溫是34度?C在空氣-緩沖器接口處。表面壓力保持在25 mN/m。

當(dāng)LDL與牛精漿以重量-蛋白質(zhì)比10:1（BSP:LDL）混合并注射到單層下方時(shí)，隨時(shí)間記錄的單層分子面積幾乎沒(méi)有變化（曲線M/SP+LDL，圖5）。400秒左右出現(xiàn)一個(gè)肩部，顯示BSP蛋白的弱吸附（該肩部代表M/SP的5%，上圖曲線）。然后，分子面積的變化在1000秒后減小并趨于穩(wěn)定。其下降幅度不如M和M/SP曲線的變化幅度大，表明LDL組分吸附，與它們?cè)诮缑嫔系母邤U(kuò)散能力一致（曲線M/LDL，圖4）。因此，由于低密度脂蛋白（LDL），SP中BSP蛋白在界面上的吸附大大減少，BSP/LDL的比率非常接近最佳值，以完全防止BSP蛋白影響單層。根據(jù)低密度脂蛋白的組成，注射磷脂酰膽堿的量估計(jì)為4.61毫克[33]。因此，向4.61 mg低密度脂蛋白磷脂酰膽堿注射26.6 mg精漿蛋白質(zhì)，即0.17 mg磷脂酰膽堿注射1 mg精漿蛋白質(zhì)。

脂質(zhì)體（不同濃度）對(duì)BSP蛋白的作用也如圖5所示。脂質(zhì)體在進(jìn)入亞階段前與精漿接觸。隨著脂質(zhì)體中濃度的增加（曲線M/SP+C1至C4），BSP蛋白吸附引起的表面積增加逐漸延遲并減少。當(dāng)含量達(dá)到4.37 mg（C3）時(shí)，界面上仍有少量BSP蛋白摻入，1600 s時(shí)出現(xiàn)肩部。在最高濃度（C4）下，未觀察到BSP蛋白摻入，分子面積的變化甚至比對(duì)照曲線更負(fù)，表明膜組分在亞相中輕微溶解。因此，脂質(zhì)體作用于BSP蛋白的方式與LDL相同。最有趣的比例似乎介于C3和C4之間。根據(jù)確定面積變化與脂質(zhì)體注射磷脂質(zhì)量之間相互作用的曲線計(jì)算得出（圖6）。注射26.6 mg BSP的最佳質(zhì)量為4.6 mg，即PC:BSP比為0.16（w/w）。

圖6。相對(duì)面積隨注射到亞相的脂質(zhì)體質(zhì)量的變化。線性回歸的R2為0.992。

3.4.脂質(zhì)體對(duì)精漿作用的顯微評(píng)價(jià)

用透射電鏡（TEM）觀察脂質(zhì)體或LDL與含有SP的BSP蛋白的混合物，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。無(wú)論放大倍數(shù)如何，與精漿相對(duì)應(yīng)的圖像均未顯示任何結(jié)構(gòu)（圖S1）。相反，與LDL和脂質(zhì)體相關(guān)的結(jié)構(gòu)很容易通過(guò)（i）LDL的致密且相當(dāng)圓的形狀（圖7A）和（ii）脂質(zhì)體的圓形且有時(shí)為多層結(jié)構(gòu)（圖7B）來(lái)識(shí)別。在存在精漿的情況下，對(duì)整套圖像的分析仍然顯示出圓形物體。它們的大小平均與未使用螯合劑分析的大小相似（圖S2）。然而，在SP存在的幾個(gè)地方，觀察到一些大的圓形物體，其特征是（i）被厚層（圖7C含LDL）包圍的天然狀結(jié)構(gòu)，或（ii）環(huán)形內(nèi)的致密核心（圖7D含脂質(zhì)體和圖S3）。與圖7B相比，與精漿混合的脂質(zhì)體系統(tǒng)地呈現(xiàn)出比天然脂質(zhì)體更致密的核心。這些新結(jié)構(gòu)可能是由于BSP蛋白滲透到界面層而導(dǎo)致膜破裂的結(jié)果，從而導(dǎo)致TEM對(duì)比度的改變。

圖7。（A）低密度脂蛋白，（B）脂質(zhì)體，（C）低密度脂蛋白和精漿（精漿中的比例為0.17 mg PC/mg BSP蛋白質(zhì)）和（D）脂質(zhì)體和精漿（精漿中的比例為0.16 mg PC脂質(zhì)體/mg BSP蛋白質(zhì)）的冷凍電鏡圖像。

4、討論

4.1.BSP蛋白的表面性質(zhì)及其可能的生物學(xué)作用

張力測(cè)定結(jié)果顯示精漿中含有表面活性成分。這些很可能是蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈儤?gòu)成精漿的主要部分。它們由幾個(gè)親水性和疏水性域組成[5]，賦予它們兩親性?？紤]到生物學(xué)背景，我們可以假設(shè)BSP蛋白能夠到達(dá)磷脂覆蓋的界面，這是由于它們與PC的相互作用和自身的表面活性。這可以解釋為什么這個(gè)過(guò)程很快[42]。將肽或蛋白質(zhì)插入磷脂單分子膜通常在比凝聚域更可壓縮的流體域中進(jìn)行[43]。34歲?C、流體域由血漿鹵素和不飽和磷脂酰膽堿組成[35]。因此，根據(jù)前面提到的涉及疏水腔的機(jī)制，BSP蛋白可以很容易地穿透這些流體結(jié)構(gòu)域，在這些流體結(jié)構(gòu)域中它們可以立即與含有磷酸膽堿的分子相互作用[11,12,34,42,44–46]。吸附的BSP量可能受到流體域可壓縮性的限制。綜上所述，BSP蛋白質(zhì)一旦被吸附，由于其表面性質(zhì)（我們的工作）、構(gòu)象重排[47]以及它們與膜組件的強(qiáng)烈相互作用[48]，仍然固定在界面上。

4.2.脂質(zhì)體和低密度脂蛋白在分離BSP蛋白中的作用

我們的結(jié)果表明，只要使用合適的脂質(zhì)體/BSP比例，脂質(zhì)體就可以像LDL一樣有效地阻止BSP蛋白到達(dá)界面。對(duì)于低密度脂蛋白，我們的模型顯示，低溫保存中常用的BSP/LDL比率（10:1 w/w）非常接近最佳值，以完全防止BSP蛋白影響單層。低密度脂蛋白組織中PC/BSP與PC的比率為0.17 mg磷脂酰膽堿，1 mg精漿蛋白質(zhì)。同樣，脂質(zhì)體的最佳比例PC/BSP為0.16 mg磷脂酰膽堿和1 mg精漿蛋白質(zhì)。知道卵子中PC的比例可能取決于喂食情況，不同批次的LDL中PC的比例可能不同，因此這些比例被認(rèn)為是相等的。該比率與LDL或脂質(zhì)體的隔離結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的事實(shí)表明，LDL中的載脂蛋白不與BSP結(jié)合，盡管這種結(jié)合是可能的[26,49]。更引人注目的是，這一結(jié)果表明PC作為L(zhǎng)DL中的單層或脂質(zhì)體中的雙層組裝沒(méi)有影響。在低密度脂蛋白的情況下，磷脂占據(jù)外層單層，并且所有這些磷脂都可被蛋白質(zhì)接近。相反，只有形成單層脂質(zhì)體的雙層外小葉的磷脂真正與BSP蛋白直接接觸。由于脂質(zhì)體和低密度脂蛋白的絡(luò)合比率相同，并且PCP分子（74%）也構(gòu)成雙層的內(nèi)小葉，因此這些分子也參與BSP蛋白的絡(luò)合。與BSP蛋白易于插入疏水膜相一致，這些BSP蛋白可向內(nèi)小葉遷移，并誘導(dǎo)脂質(zhì)體雙層破裂/融合，如TEM所觀察到的。然而，樣品中LDL和脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變化并不普遍，BSP蛋白可以認(rèn)為主要錨定在LDL和脂質(zhì)體的表面。當(dāng)脂質(zhì)體與BSP的比例高于本文所研究的比例時(shí)，BSP1（BSP家族中的主要蛋白質(zhì)）誘導(dǎo)脂質(zhì)小泡的伸長(zhǎng)和珠項(xiàng)鏈狀結(jié)構(gòu)的形成，這些結(jié)構(gòu)演變?yōu)樾∨莼蚓€狀結(jié)構(gòu)[50]。

5、結(jié)論

首先，表面張力測(cè)量證明牛精漿具有很好的表面活性，可能與BSP蛋白有關(guān)。其次，Langmuir膜法（先前被證明是公牛精子外細(xì)胞膜的相關(guān)脂質(zhì)單層模型[35]）有助于表征BSP蛋白對(duì)脂質(zhì)膜的親和力。BSP蛋白能夠到達(dá)被磷脂覆蓋的牛精子細(xì)胞表面，這得益于它們與磷脂酰膽堿的相互作用和自身的表面活性。我們的假設(shè)是，由于它們自身的表面活性，它們首先穿透精子的外小葉，然后由于與磷脂酰膽堿的強(qiáng)烈相互作用而留在那里。最后，利用Langmuir膜法對(duì)已知的BSP蛋白螯合劑如ldl和脂質(zhì)體的作用進(jìn)行了篩選。脂質(zhì)體與低密度脂蛋白一樣有效地阻止BSP蛋白插入磷脂層。低密度脂蛋白和脂質(zhì)體的比例相同：0.16–0.17 mg磷脂酰膽堿/mg BSP。我們還不知道在冷凍保存的時(shí)間尺度上脂質(zhì)體的非常微弱的插入是否有一些生物學(xué)后果。需要進(jìn)一步研究分析每種BSP蛋白的表面性質(zhì)及其在膜上的作用。此外，可以測(cè)試Langmuir膜，以檢測(cè)BSP與膜的親和力隨溫度的變化[20]。最后，Langmuir膜法是一種有效的篩選BSP蛋白質(zhì)新螯合劑的方法。該方法可適用于其他動(dòng)物物種。

致謝

作者感謝IMV Technologies（法國(guó)）的財(cái)務(wù)支持，Gérard Chatagnon負(fù)責(zé)精漿蛋白質(zhì)定量，Véronique Solé負(fù)責(zé)凝膠電泳，Maureen Collobert負(fù)責(zé)英語(yǔ)校正，Alain Sire和Patrice Papineau負(fù)責(zé)手套箱的構(gòu)思和實(shí)現(xiàn)，允許在受控大氣中使用朗繆爾槽。