3.結(jié)果和討論

3.1.分層

為了了解空氣/水表面乳清蛋白的存在和數(shù)量如何影響HFBII的表面流變性，第一步是觀察純體系和混合體系的鋪展層。觀察擴(kuò)散層的主要優(yōu)點(diǎn)是表面成分已知，假設(shè)幾乎所有應(yīng)用于界面的蛋白質(zhì)都會(huì)擴(kuò)散并留在界面上。圖1顯示了純HFBII和純?nèi)榍宓鞍准捌浠旌衔锏谋砻鎵毫Φ葴鼐€。正如之前的研究[8,24]所知，與乳清蛋白相比，HFBII使表面壓力急劇上升，其行為更像剛性顆粒，而乳清蛋白則表現(xiàn)出更柔軟、更像聚合物的行為。據(jù)推測(cè)，由于乳清蛋白在界面處的構(gòu)象變化，即展開，以及其大分子量，表面壓力在較低的表面負(fù)荷下升高。然而，上升幅度遠(yuǎn)小于HFBII，乳清蛋白達(dá)到的最大表面壓力也較低。關(guān)于混合層的等溫線，可以觀察到，對(duì)于低水平，曲線移動(dòng)到稍大的表面積，曲線的形狀仍然讓人想起純WPI曲線。當(dāng)混合物中HFBII的比例上升到1:1或更高時(shí)，曲線的陡度增加，表面壓力開始在較小的表面積處形成。另一個(gè)需要提及的重要事項(xiàng)是，對(duì)于純HFBII，由于HFBII層的2D相變和凝固[11]，應(yīng)注意22 mN/m以上的表面壓力值，從而形成具有顯著屈服應(yīng)力的強(qiáng)彈性表面，可維持局部吸附和變形梯度[25]。因此，高于該值時(shí)，表面壓力傳感器附近的局部表面變形可能不同于全球平均變形。宏觀上，這也表現(xiàn)在表面上形成褶皺，這也表明了不均勻的變形和應(yīng)力分布，如下所述。

圖1。純蛋白質(zhì)系統(tǒng)WPI（右）和HFBII（左）以及口糧WPI:HFBII為10:1、3:1、1:1、1:3和1:10的混合系統(tǒng)的表面壓力等溫線。

值得注意的是，對(duì)于純HFBII，П–A等溫線在連續(xù)的壓縮膨脹循環(huán)中不會(huì)發(fā)生變化，這再次表明HFBII不可撤銷地附著在界面上，幾乎沒有任何構(gòu)象變化。對(duì)于純WPI和1:1混合物，П–A等溫線略微向較小區(qū)域移動(dòng)，這表明由于WPI分子的構(gòu)象變化、多層形成或如前所述，由于WPI的解吸，表面重排的可能性較小。

為了便于比較，從圖1的數(shù)據(jù)中，使用表面壓力第一次上升的斜率（由第一次壓縮產(chǎn)生）和公式E=（?2）提取了表觀膨脹模量（E）??1）/ln（A1/A2）。曲線的斜率總是在表面壓力在15到25 mN/m之間波動(dòng)的表面積范圍內(nèi)確定的。圖2顯示了表觀模量作為混合比的函數(shù)，表示為HFBII分?jǐn)?shù)fHFBII=cHFBII/（cHFBII+cWPI）。

圖2。表觀模量作為擴(kuò)散層HFBII分?jǐn)?shù)的函數(shù)，以及槽屏障之間界面上褶皺斑塊的圖示。右邊是純HFBII層的一個(gè)褶皺斑的顯微鏡照片。

從圖2中可以看出，HFBII分?jǐn)?shù)高達(dá)0.5的混合層，WPI的存在似乎主導(dǎo)了П15至25 mN/m之間界面處的表面流變行為。僅觀察到表面模量略有增加，此外，觀察到界面完全光滑。從HFBII分?jǐn)?shù)為0.75開始，行為開始顯示HFBII層的特性。基于表觀模量，從WPI主導(dǎo)行為到HFBII主導(dǎo)行為的轉(zhuǎn)變對(duì)應(yīng)于褶皺斑塊的視覺觀察，這對(duì)于壓力高于22 mN/m的純HFBII層來說是典型的。最后，在純HFBII系統(tǒng)中，斑塊相互連接，并觀察到最高模量，表明已知的HFBII行為。從這些觀察結(jié)果可以清楚地看出，在較低的HFBII/WPI比率下，富HFBII的疇的表面分離，包圍著富WPI的2D相，隨著HFBII比率的增加，這些疇的大小增加，它們變得相互連接，因此在fHFBII=0.6左右時(shí)，表面變得以HFBII為主。

3.2.吸附層

發(fā)泡系統(tǒng)的下一步是觀察吸附層。與擴(kuò)散層相反，表面成分未知；只有蛋白質(zhì)的體積比是已知的。此外，表面成分可能會(huì)隨時(shí)間而變化，因?yàn)槌私缑嫔蟇PI可能發(fā)生的構(gòu)象變化外，表面和本體之間的材料連續(xù)交換是可能的。

圖3顯示了表面壓力隨時(shí)間的變化。第一次～100 s后，清潔表面后，屏障仍在膨脹（程序說明見第2.2.2節(jié)），而在實(shí)驗(yàn)開始后100 s至1000 s之間，表面積保持恒定，以允許吸附層形成并平衡。從1000秒開始，界面被壓縮，因此表面壓力增加。與在擴(kuò)展層中觀察到的情況類似（在一個(gè)周期內(nèi)，時(shí)間和面積呈線性關(guān)系），純HFBII的表面壓力增加斜率遠(yuǎn)高于純WPI。大約2500秒后，表面再次膨脹，導(dǎo)致表面壓力降低。同樣在混合系統(tǒng)中，表面壓力在1000 s后趨于平穩(wěn)。應(yīng)注意1000 s后平衡表面壓力的絕對(duì)值，因?yàn)樵?2 mN/m以上以HFBII為主的層的情況下，界面變得有彈性，在0秒清潔表面后，可能會(huì)出現(xiàn)皺紋，并且針重新進(jìn)入表面。在清潔界面和針浸入界面之間，可能已經(jīng)吸附了一些蛋白質(zhì)（當(dāng)使用吸附層時(shí)，與使用鋪展層相比，校準(zhǔn)表面張力并不容易，因?yàn)槲綄?shí)驗(yàn)并不像使用鋪展層那樣從清潔的純水界面開始）然而，吸附過程中的曲線形狀，壓縮和膨脹提供了有關(guān)吸附層功能的重要信息。從1000秒開始，第一次壓縮開始，在大約2500秒時(shí)，接口再次擴(kuò)展。

現(xiàn)在，讓我們討論擴(kuò)散和吸附HFBII和WPI層之間的差異（見圖1和圖3）。擴(kuò)散層和吸附層的吸附等溫線形狀大致相似。主要區(qū)別在于記錄開始時(shí)表面壓力較高。對(duì)于鋪展層，選擇施加蛋白質(zhì)的量，使施加后的表面壓力在第一次壓縮前上升至約1 mN/m。在吸附的情況下，界面上蛋白質(zhì)的數(shù)量，以及表面壓力取決于吸附速率。吸附速率取決于蛋白質(zhì)在本體中的濃度及其表面活性。該濃度選擇得相當(dāng)高（0.1 mg/ml），因此吸附在界面上的蛋白質(zhì)量不會(huì)顯著影響整體蛋白質(zhì)濃度。

同樣在視覺觀察中（見圖5），觀察到了與傳播系統(tǒng)的相似性。照片是從朗繆爾槽中的吸附層和壓縮層拍攝的。觀察到，在HFBII分?jǐn)?shù)為0.33及以上的吸附層中，會(huì)形成典型的HFBII褶皺，這與擴(kuò)散層不同，在擴(kuò)散層中，從fHFBII分?jǐn)?shù)為0.75起觀察到褶皺（重要的是要記住，第一個(gè)是體積中的蛋白質(zhì)比率，第二個(gè)是界面處的蛋白質(zhì)比率）。另一個(gè)區(qū)別是，在吸附系統(tǒng)中，皺紋更多地出現(xiàn)在屏障處的彎月面上，而在擴(kuò)散系統(tǒng)中，皺紋出現(xiàn)在均勻分布在槽區(qū)的斑塊中（見圖2）。

圖5。在液體中不同疏水組分的朗繆爾槽上，HFBII/WPI混合溶液的吸附層照片：a:fHFBII=1，B:fHFBII=0.67，C:fHFBII=0.5，D:fHFBII=0.33。

圖4給出了純系統(tǒng)和一個(gè)混合系統(tǒng)在幾個(gè)壓縮/膨脹循環(huán)期間的表面壓力等溫線。我們注意到，在該圖中，HFBII和WPI的表面積按擴(kuò)展系統(tǒng)曲線中彎曲點(diǎn)的出現(xiàn)比例縮放（圖1）。已知這一點(diǎn)反映了表面中明顯的緊密堆積轉(zhuǎn)變[8]。第一次壓縮導(dǎo)致的表面壓力的初始上升可以轉(zhuǎn)化為表觀膨脹模量，類似于對(duì)鋪展層所做的，盡管蛋白質(zhì)的總量可能會(huì)因吸附而變化，因此在這種情況下，吸附和表面積是不可互換的。由于表面壓力的絕對(duì)值是未知的，所以決定考慮在壓縮時(shí)表面壓力的第一個(gè)10 Mn/m的上升來計(jì)算模量。圖7（上圖）給出了表觀模量與本體溶液中HFBII分?jǐn)?shù)的函數(shù)關(guān)系。從圖中可以看出，從HFBII分?jǐn)?shù)為0.33或以上的情況來看，吸附層以HFBII為主。這與皺紋的出現(xiàn)是一致的（圖5）。

圖4。?/A-純HFBII、純WPI及其1:10混合物的吸附系統(tǒng)的等溫線，所有這些系統(tǒng)的總蛋白質(zhì)濃度均為0.1 mg/ml。等溫線包括第一個(gè)壓縮/膨脹循環(huán)和5個(gè)滯后環(huán)。將HFBII和WPI的表面積縮放至攤鋪系統(tǒng)曲線中彎曲點(diǎn)的出現(xiàn)，對(duì)應(yīng)于表面的明顯緊密堆積過渡（圖1）。

有趣的是，將吸附層（圖7，頂部）的過渡點(diǎn)與HFBII占主導(dǎo)地位的行為進(jìn)行比較，前者大致介于HFBII（整體）0.2和0.3（圖6）之間，后者大致位于0.6（表面）的擴(kuò)散層（圖2）之間。假設(shè)這種情況發(fā)生在大致相同的表面成分上，這將表明0.2 HFBII:WPI本體成分對(duì)應(yīng)于界面處的0.6 HFBII:WPI，毫不奇怪地證實(shí)HFBII比WPI更具表面活性。當(dāng)然，應(yīng)該注意的是，吸附實(shí)驗(yàn)中存在的HFBII的絕對(duì)量高于擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中的HFBII絕對(duì)量，并且由于來自塊體的額外蛋白質(zhì)吸附，界面處的比率可能會(huì)隨著壓縮/膨脹循環(huán)而改變，如下文所述，可能會(huì)形成多層。

圖6。表觀模量E是WPI和HFBII混合溶液中吸附層HFBII分?jǐn)?shù)的函數(shù)。

當(dāng)仔細(xì)觀察混合吸附層（圖4）的表面壓力等溫線時(shí)，很明顯，?/a曲線隨著每個(gè)壓縮循環(huán)向左移動(dòng)（面積較?。兊鞍踪|(zhì)的曲線在第一次膨脹/壓縮循環(huán)后幾乎沒有變化，在第一次膨脹/壓縮循環(huán)中，各層或多或少處于平衡狀態(tài)。純體系的行為可以用這樣一個(gè)事實(shí)來解釋：蛋白質(zhì)實(shí)際上是不可逆地吸附在界面上的（從鋪展層的實(shí)驗(yàn)中也可以清楚地看到）。在膨脹的前幾個(gè)循環(huán)中，更多的蛋白質(zhì)可以吸附在自由表面，直到在最大膨脹點(diǎn)達(dá)到“平衡”。當(dāng)系統(tǒng)被壓縮時(shí)，由于蛋白質(zhì)不能解吸，各層被簡(jiǎn)單地壓縮（對(duì)于WPI而言，部分表面展開），并且可能形成一種結(jié)構(gòu)，WPII不能完全從界面解吸，而是垂直重新排列，并在富含HFBII的層下方形成第二層。這一假設(shè)用圖7中的圖表和下面的討論加以說明。在接下來的膨脹周期中，一些新的蛋白質(zhì)可以繼續(xù)吸附，但由于現(xiàn)在表面濃度已經(jīng)高于平衡體積濃度，沒有新的蛋白質(zhì)會(huì)被吸附。此外，表面下第二層和靠近開放區(qū)域的WPI可以“翻轉(zhuǎn)”并填充膨脹間隙，比任何新的蛋白質(zhì)從塊體中吸附的速度都快。這樣，就達(dá)到了一種穩(wěn)定狀態(tài)。

圖7。重復(fù)壓縮和膨脹后HFBII:WPI混合層結(jié)構(gòu)形成示意圖。請(qǐng)注意，乳清蛋白的主要成分BLG僅在此處顯示。壓縮：BLG的一部分從表面排出，形成一個(gè)子層。膨脹：BLG的一部分停留在亞表層，而另一部分可能重新吸附到主層。頂面存在HFBII的凈濃度。

吸附混合系統(tǒng)的行為非常有趣，值得進(jìn)一步討論。?/A等溫線向左移動(dòng)的事實(shí)表明，在逐漸膨脹和壓縮后，該層變得越來越緊密，接近純HFBII的表面覆蓋。這似乎得到了以下事實(shí)的支持：壓縮后的坡度增加，并且越來越接近HFBII的坡度，這再次表明層行為逐漸由HFBII主導(dǎo)。對(duì)此幾乎沒有可能的解釋：（i）WPI在界面上的構(gòu)象變化（HFBII更為剛性），這在純體系中是不存在的，但當(dāng)兩種蛋白質(zhì)混合時(shí)會(huì)以某種方式出現(xiàn)。然而，這是不可能的，否則我們也會(huì)在擴(kuò)散層中看到它的跡象；（ii）界面處的拓?fù)渲嘏?，最初界面?D WPI連續(xù)的，WPI占主導(dǎo)地位，有一些分散的HFBII 2D域。這些域?qū)⒃趬嚎s和擴(kuò)展后逐漸互連，并形成HFBII連續(xù)網(wǎng)絡(luò)（在2D中，雙連續(xù)階段在拓?fù)渖鲜遣豢赡艿模?。如果這種情況再次發(fā)生，我們希望在擴(kuò)散層中看到類似的趨勢(shì)，但事實(shí)并非如此（或在非常有限的程度上）；（iii）由于WPI在界面上的吸附/解吸，界面中蛋白質(zhì)的組成發(fā)生變化，這同樣不太可能，因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)的吸附能都很高，最后（iv）在界面上形成多層結(jié)構(gòu)，其中頂層富含HFBII并占主導(dǎo)地位，而底層富含WPI并吸附到頂層。后者可能是因?yàn)榧词笻FBII分子的親水部分仍然含有大量疏水氨基酸，因此也是相對(duì)疏水的，并且由于HFBII和WPI下面的靜電斥力預(yù)計(jì)非常低，因?yàn)镠FBII表面層的等電點(diǎn)接近中性，這是這些系統(tǒng)中的相關(guān)pH值[10]。如果為真，這將給出系統(tǒng)的中間配置狀態(tài)，介于WPI在界面處完全吸附和完全解吸之間，具有非常高的能量差。我們還看到混合鋪展層（見圖1）情況下的這種行為相似，但這與體相中沒有WPI的情況不太明顯。

3.3.泡沫實(shí)驗(yàn)環(huán)境和壓力循環(huán)

在前幾段中，我們考慮了HFBII和WPI在空氣/水界面的擴(kuò)散和吸附層。在本節(jié)中，我們?cè)噲D將蛋白質(zhì)在界面上的行為與泡沫的形成和穩(wěn)定性聯(lián)系起來。在這里，當(dāng)我們根據(jù)初始?xì)馀莩叽鐏砻枋雠菽詴r(shí)，應(yīng)該注意，初始?xì)馀莩叽缛Q于泡沫性和泡沫穩(wěn)定性（形成后立即），因?yàn)樵跍y(cè)量初始?xì)馀莩叽缰?，泡沫與0.5%黃原膠溶液混合。黃原膠為系統(tǒng)提供了微弱的表觀屈服應(yīng)力，足以阻止奶油化和氣泡再發(fā)酵，因此我們只能研究隨后的粗化過程[8]。

圖8給出了以與圖3相同的HFBII:WPI比率制備的兩種泡沫的初始?xì)馀莩叽?。最重要的觀察結(jié)果是，少量HFBII（來自fHFBII 0.03）在很大程度上影響泡沫的初始?xì)馀莩叽纭４送?，似乎從WPI主導(dǎo)向HFBII主導(dǎo)的行為轉(zhuǎn)變發(fā)生在fHFBII～=0.2，對(duì)應(yīng)于朗繆爾槽中吸附層中觀察到的轉(zhuǎn)變（圖6）。

圖3。吸附0.1 mg/ml HFBII和WPI期間的表面壓力與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系；包括第一次壓縮/膨脹循環(huán)（左）和壓縮和膨脹期間吸附的HFBII和WPI層的表面壓力等溫線。

圖8。根據(jù)濁度掃描測(cè)量評(píng)估的環(huán)境充氣泡沫和壓力循環(huán)泡沫的初始?xì)馀莩叽纾ㄓ?.5%黃原膠稀釋后）。

這表明，與鋪展層相比，泡沫中的成分功能性更好地對(duì)應(yīng)于吸附層，這是有道理的，因?yàn)樵谂菽纬善陂g，蛋白質(zhì)層是通過吸附而不是在氣泡表面鋪展形成的，當(dāng)氣泡通過攪拌器攪拌附近的高剪切區(qū)時(shí)，蛋白質(zhì)層也會(huì)膨脹和收縮。最后的觀察結(jié)果是，當(dāng)空氣/水界面以HFBII為主時(shí)，壓力循環(huán)樣品的初始?xì)馀莩叽缢坪醣任催M(jìn)行壓力循環(huán)的樣品小。

氣泡尺寸隨時(shí)間的相對(duì)增加如圖9所示，表示為d2（t）/d2（0）。考慮到環(huán)境充氣樣品的泡沫穩(wěn)定性，對(duì)于純HFBII系統(tǒng)，在本實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)平均氣泡尺寸的顯著變化，表明幾乎不可能發(fā)生任何歧化。在純WPI的情況下，可以發(fā)現(xiàn)氣泡尺寸急劇增加，表明對(duì)歧化的穩(wěn)定性較差。在混合情況下，隨著fHFBII的增加，我們可以看到氣泡尺寸穩(wěn)定性增加的趨勢(shì)。我們可以粗略地說，當(dāng)fHFBII<0.2時(shí)，氣泡大小的初始演化在很大程度上取決于WPI。然而，當(dāng)fHFBII>0.2時(shí)，HFBII的存在控制泡沫穩(wěn)定性。這與在朗繆爾槽中觀察到的初始?xì)馀荽笮『臀綄拥内厔?shì)非常一致。

圖9。使用TurbirScan根據(jù)氣泡尺寸演變?cè)u(píng)估泡沫穩(wěn)定性

對(duì)于0.03<fHFBII<0.2的泡沫中氣泡尺寸的增加，觀察到在初始粗化數(shù)小時(shí)后，曲線趨于平穩(wěn)。在粗化過程中，小氣泡的收縮和總氣泡中較大氣泡的增長導(dǎo)致泡沫總表面積的凈減少。上述結(jié)果表明，氣泡穩(wěn)定性隨著表面積的逐漸減小而增加，這與朗繆爾槽上吸附系統(tǒng)在大變形壓縮/膨脹循環(huán)中觀察到的行為一致。

4.結(jié)論

在朗繆爾槽上研究了空氣/水界面上分散和吸附的WPI/HFBII層，其性質(zhì)與泡沫的形成和穩(wěn)定性有關(guān)。在擴(kuò)散和吸附系統(tǒng)中，觀察到模量隨著表面或亞相中HFBII的分?jǐn)?shù)逐漸增加，我們可以確定WPI主導(dǎo)行為和HFBII主導(dǎo)行為的區(qū)域。通過對(duì)混合表層皺紋的目視觀察，進(jìn)一步證實(shí)了HFBII的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)比較擴(kuò)散和吸附系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)需要更高的HFBII分?jǐn)?shù)才能在擴(kuò)散層中獲得HFBII主導(dǎo)行為，而不是吸附層（fHFBII分別為0.6和0.2）。此外，我們的結(jié)果表明，與擴(kuò)散層相比，在連續(xù)的大規(guī)模壓縮/膨脹循環(huán)中，吸附層中蛋白質(zhì)的組成會(huì)發(fā)生變化。我們解釋了擴(kuò)散層和吸附層之間的差異，可能在界面處形成雙層/多層，頂層較硬，主要由HFBII控制，底層較軟，主要由WPI控制。這兩層的作用類似于平行連接的粘彈性膜，整體表面性質(zhì)由較強(qiáng)的富HFBII層控制。從真實(shí)泡沫的初始?xì)馀莩叽缂捌淇勾只拈L期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來看，泡沫行為與吸附層中測(cè)量的表面膨脹特性密切相關(guān)。最后，我們觀察到，在HFBII和WPI的混合體系中，粗化過程隨著時(shí)間的推移逐漸趨于平穩(wěn)，這進(jìn)一步支持了我們關(guān)于氣泡表面多層形成的假設(shè)。

致謝

作者衷心感謝Jeoffrey Jansen先生對(duì)Turbuscan實(shí)驗(yàn)的幫助。荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)部的魯本·阿諾多夫博士和英國科爾沃思聯(lián)合利華研發(fā)部的安德魯·考克斯博士因激發(fā)討論而受到認(rèn)可。這項(xiàng)工作由荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)中心弗拉丁根提供資金和執(zhí)行。