3.結(jié)果

3.1.體外抗癌能力和選擇性

G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）肽是通過Fmoc固相肽合成協(xié)議[9e11]合成的。CD研究表明，這些肽主要存在于緩沖溶液中的無序結(jié)構(gòu)中。在添加到DPPG（二棕櫚酰磷脂酰甘油）SUV（模擬帶負(fù)電荷的細(xì)菌和癌細(xì)胞膜的小單層囊泡）中后，除了GIIKKI-NH2外，肽采用a-螺旋構(gòu)象。兩親螺旋結(jié)構(gòu)有利于它們與脂質(zhì)雙層的相互作用，但GIIKKI-NH2始終保持未折疊狀態(tài)，無論周圍環(huán)境發(fā)生任何變化。二級(jí)結(jié)構(gòu)的這種缺乏變化與其缺乏生物活性很好地一致。隨后的細(xì)胞研究集中于n?2、3和4的系列。

按照濃度依賴性模式，重復(fù)次數(shù)較多或長度較長的肽在殺死癌細(xì)胞（HeLa和HL60細(xì)胞）方面更有效，但對正常細(xì)胞（紅細(xì)胞和HDFa細(xì)胞）的體外毒性也開始增加，如圖1aec所示?？偟膩碚f，就體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性而言，G（IIKK）3I-NH2是最佳序列，其對HeLa和HL60細(xì)胞的IC50值為15和25 mM，EC50遠(yuǎn)大于250 mM（IC50：濃度導(dǎo)致50%的癌細(xì)胞生長抑制；EC50：濃度誘導(dǎo)50%的紅細(xì)胞溶解）。重要的是，HDFa細(xì)胞對這些肽有良好的耐受性，例如，在濃度低于50 mM時(shí)，G（IIKK）3I-NH2對HDFa細(xì)胞的影響微不足道（圖1c）。我們合理設(shè)計(jì)的短肽的這種性能明顯優(yōu)于天然AMP，如馬蓋寧和蜂毒素，并且在有效性、選擇性甚至耐藥性方面也優(yōu)于抗癌藥物順鉑[12e15]。例如，在類似的實(shí)驗(yàn)條件下，magainin-2對HeLa細(xì)胞的IC50低于60 mM，而蜂毒肽在5 mM下的EC50則低得多，顯示出對宿主細(xì)胞的高毒性[12e14]。

圖1。設(shè)計(jì)的a-螺旋肽的細(xì)胞毒性和選擇性。（a）對HeLa和HL60細(xì)胞的細(xì)胞毒性。（b）人類紅細(xì)胞溶血。（c）對HDFa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。（d）FITC-G（IIKK）3I-NH2在含有HL60癌細(xì)胞和HDFa原代細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中的分布。

然后，我們進(jìn)一步評估了基于體外共培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞選擇性，該系統(tǒng)包含HL60癌細(xì)胞和HDFa原代細(xì)胞，它們與體內(nèi)環(huán)境非常相似[8]。將最終濃度為20 mM的FITC-G（IIKK）3I-NH2添加到系統(tǒng)中，培養(yǎng)1 h后，用熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞中的肽分布（圖1d）。很明顯，綠色熒光集中在懸浮和圓形HL60細(xì)胞中，而不是粘附和紡錘形HDFa細(xì)胞中，這再次表明肽具有良好的細(xì)胞選擇性，以及對癌細(xì)胞的快速識(shí)別。

3.2.肽與脂質(zhì)單層的選擇性相互作用

在這個(gè)階段，這些肽的選擇性背后的機(jī)制過程在很大程度上仍不清楚，但抗癌肽主要是膜活性的，它們對癌細(xì)胞的作用方式涉及膜破壞。此外，它們對癌細(xì)胞的選擇性殺傷與癌細(xì)胞的兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞膜特征密切相關(guān)，即凈負(fù)表面電荷和更大的膜流動(dòng)性[2,3,16]。為了了解肽和細(xì)胞膜之間的特殊相互作用以及分子水平上抗癌作用的基本過程，我們轉(zhuǎn)向使用脂質(zhì)單層的膜模型。圖2a顯示了在最終濃度為3 mM的條件下，將G（IIKK）（2e4）I-NH2注入亞相時(shí)，DPPC（二棕櫚酰磷脂酰膽堿）和DPPG單層（分別模擬正常哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和癌細(xì)胞外膜）的表面壓力從不同的初始表面壓力（pi）增加（Dp），同時(shí)保持表面積不變。所有的肽都表現(xiàn)出對帶負(fù)電荷的DPPG單層的明顯偏好，而對兩性離子DPPC單層的親和力則要小得多。在Dp?0處對每個(gè)壓力圖進(jìn)行外推，得出排除壓力，超過該壓力，肽不再能夠穿透脂質(zhì)單層，從而導(dǎo)致表面壓力進(jìn)一步增加。對于兩性離子DPPC單層，G（IIKK）2I-NH2的排斥壓力為23.4 mN/m，遠(yuǎn)低于生物膜的30e35 mN/m生理范圍[17,18]，這與其對紅細(xì)胞的毒性很小相符。相比之下，G（IIKK）（3e4）I-NH2的值分別增加到32.0和37.6 mN/m，這與它們的溶血活性增加一致。另一方面，對于帶負(fù)電荷的DPPG單層，排斥壓力分別顯著增加至37.3、40.6和42.6 mN/m，表明陽離子肽電荷和陰離子脂質(zhì)頭基團(tuán)之間的靜電相互作用起著關(guān)鍵作用。盡管DPPC和DPPG單分子膜對G（IIKK）2I-NH2的排斥壓差較大（參見補(bǔ)充數(shù)據(jù)，圖S1），但其對后者的排斥壓僅略高于生物膜30e 35 mN/m的生理范圍，這與其殺死癌細(xì)胞的效率較低一致，因此，這種肽在癌癥治療中沒有吸引力。另一方面，G（IIKK）4I-NH2對兩性離子DPPC單分子膜的排斥壓力為37.6 mN/m，略高于30e35 mN/m的生理范圍，這與該系列中表現(xiàn)出的最高溶血能力一致。G（IIKK）3I-NH2顯示出中間值，DPPC單層的Dp值為32.0 mN/m，DPPG單層的Dp值為40.6 mN/m，這與體外細(xì)胞工作中的最佳細(xì)胞選擇性一致。

圖2。肽與不同脂質(zhì)單層的相互作用。（a）當(dāng)肽以3 mM濃度注入亞相時(shí)，在不同初始表面壓力（pi）下，DPPC和DPPG單分子膜的表面壓力增加（Dp）。（b）將G（IIKK）3I-NH2注入DPPC和POPC單分子膜的亞相后的表面壓力與時(shí)間的關(guān)系。

癌細(xì)胞中膽固醇水平的降低和具有不飽和脂肪酰鏈的脂質(zhì)的增加可能是膜流動(dòng)性增加的原因[19]。將最終濃度為3 mM的G（IIKK）3I-NH2注入亞相后，飽和DPPC和不飽和棕櫚酰油酰磷酰膽堿（POPC）單分子膜的平衡表面壓力增加趨于3.5和10 mN/m，初始表面壓力為30 mN/m（圖2b），表明無論膜電荷相互作用如何，增加的膜流動(dòng)性確實(shí)有利于表面活性肽的膜滲透。

3.3.肽的原位定位和質(zhì)膜完整性

為了在與HeLa細(xì)胞孵育期間精確定位抗癌肽，使用濃度為10 mM的FITC-G（IIKK）3I-NH2，并使用激光共聚焦顯微鏡觀察其在這些細(xì)胞中的熒光分布，與孵育時(shí)間有關(guān)。孵育1小時(shí)后，大部分FITC衍生信號(hào)（綠色（網(wǎng)絡(luò)版））位于HeLa細(xì)胞膜上，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到相對較弱的熒光信號(hào)（圖3a），表明細(xì)胞周圍的膜是這一時(shí)期的主要靶點(diǎn)。然而，孵育24小時(shí)后，熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)積累（圖3b），表明肽穿過外脂雙層的易位。此外，處理24小時(shí)后，細(xì)胞邊界變得明顯模糊，這可能是因?yàn)樵诖诉^程中細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)逐漸退化。因此，人們很好地預(yù)期，在易位后，肽會(huì)與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)（如線粒體）相互作用，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖3。肽的原位定位和質(zhì)膜完整性。（a）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育1h后HeLa細(xì)胞中的肽位置。（b）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育24h后HeLa細(xì)胞中的肽位置。（c）未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞的代表性SEM顯微照片。（d）用10mM G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞的代表性SEM顯微照片。

為了確定與肽結(jié)合后的膜通透性，我們進(jìn)行了鈣黃綠素AM釋放試驗(yàn)。與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育10 min導(dǎo)致約20%的鈣黃綠酸從HeLa細(xì)胞中釋放，表明其對癌細(xì)胞膜的快速滲透作用（參見補(bǔ)充數(shù)據(jù)，圖S2）。正如預(yù)期的那樣，增加培養(yǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致更多的膜通透性，在培養(yǎng)6小時(shí)后，鈣黃綠素AM的釋放超過40%。在較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，明顯的膜通透性與上述觀察到的肽與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合非常一致。

為了直接觀察G（IIKK）3I-NH2對細(xì)胞形態(tài)的影響，特別是在大多數(shù)肽分子轉(zhuǎn)移到膜上的較長培養(yǎng)時(shí)間后，我們進(jìn)行了SEM檢查。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞顯示出正常的光滑表面，相鄰細(xì)胞之間具有良好的細(xì)胞間接觸（圖3c）。相比之下，用10 mM G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)出明顯的改變（圖3d）。觀察到收縮的細(xì)胞膜明顯破裂和溶解。除了細(xì)胞膜損傷外，一些處理過的細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的表面起泡（圖3d的右圖），這是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的特征性事件[20]。

3.4.細(xì)胞凋亡

由于肽易位到細(xì)胞質(zhì)中，并且治療后的癌細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)學(xué)，我們隨后遵循了細(xì)胞凋亡的幾個(gè)關(guān)鍵生化和形態(tài)學(xué)特征，旨在將凋亡誘導(dǎo)與HeLa細(xì)胞死亡聯(lián)系起來，并揭示可能的凋亡途徑。

3.4.1.核形態(tài)變化與DNA斷裂

染色質(zhì)凝聚與DNA片段化平行是用于識(shí)別細(xì)胞凋亡的可靠標(biāo)準(zhǔn)[21]。通過對細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，我們首先比較了在37C溫度下用10 mM G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核變化（圖4a）。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則且完整，彌漫性DAPI染色。相反，隨著熒光強(qiáng)度的增加，肽處理的細(xì)胞核形狀發(fā)生改變，染色質(zhì)聚集成不規(guī)則的致密團(tuán)塊。此外，在不同的培養(yǎng)時(shí)間從處理過的HeLa細(xì)胞中提取基因組DNA，然后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。孵育12小時(shí)后，出現(xiàn)寡核苷酸大小的DNA片段，并且隨著孵育時(shí)間的增加，模式變得更加明顯（圖4b）。相比之下，從未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞中分離的DNA條帶是單一的，沒有發(fā)生DNA斷裂。有人提出，一旦染色質(zhì)完整性受損，一些激活酶（如內(nèi)源性核酸酶）負(fù)責(zé)將染色質(zhì)DNA切割成180e200 bp的片段及其整數(shù)倍[22e 24]。

圖4。細(xì)胞凋亡的生化和形態(tài)學(xué)特征。（a）HeLa細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)前后的DAPI核染色。（b）HeLa細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后提取的基因組DNA的凝膠電泳分析。（c）在與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)之前和之后，用FITC phalloidin對HeLa細(xì)胞進(jìn)行F-肌動(dòng)蛋白染色。

3.4.2.細(xì)胞骨架改變

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在介導(dǎo)細(xì)胞對內(nèi)部和外部信號(hào)的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[25]。它有一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，具有獨(dú)特的形式，適用于運(yùn)動(dòng)、粘附、分裂和細(xì)胞死亡等特定任務(wù)[26e28]。異常F-肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的發(fā)展密切相關(guān)，通常伴隨著ROS的線粒體釋放[28]。在與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育之前和之后，用FITC phalloidin對HeLa細(xì)胞進(jìn)行染色，以顯示F-肌動(dòng)蛋白（絲狀肌動(dòng)蛋白）。對于未經(jīng)處理的細(xì)胞，纖細(xì)的微絲束平行于細(xì)胞的長軸，而F-肌動(dòng)蛋白隨著處理的細(xì)胞變得紊亂和縮短（圖4c）。

3.4.3.線粒體途徑

線粒體在細(xì)胞凋亡中起著核心作用，凋亡死亡中的許多關(guān)鍵因素和事件都受其調(diào)控。一些凋亡蛋白可以靶向線粒體，通過形成膜孔或增加線粒體膜通透性導(dǎo)致線粒體腫脹。這兩個(gè)過程都允許釋放凋亡效應(yīng)器[29e32]。在這項(xiàng)工作中，成功地觀察到線粒體途徑與細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們首先以JC-1為探針，觀察線粒體膜電位的變化[33]。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞顯示線粒體橙紅色熒光和少量綠色熒光（網(wǎng)絡(luò)版）。與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)后，綠色熒光占主導(dǎo)地位（圖5a），表明線粒體膜電位顯著喪失。線粒體膜電位的這種去極化通常伴隨著線粒體膜通透性的增加和Cyt c的釋放[34]。然后，我們進(jìn)行了免疫熒光成像，該成像顯示未經(jīng)處理的細(xì)胞中Cyt c的清晰、顆粒狀染色模式，與G（IIKK）3I-NH2處理的細(xì)胞中Cyt c的更彌散染色形成對比（圖5b）。這種差異表明細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與觀察到的線粒體膜電位去極化高度一致。在細(xì)胞質(zhì)中，釋放的Cyt-c可以在dATP存在下誘導(dǎo)Apaf-1和caspase-9之間的相互作用，從而進(jìn)一步激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡[35]。

圖5.圖5。線粒體功能障礙與Fas-FasL通路。（a）用10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的JC-1線粒體膜電位染色的熒光圖像。（b）用10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的Cyt c免疫熒光染色。（c）Caspase-8，與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后HeLa細(xì)胞的fas-L和fas基因轉(zhuǎn)錄。

3.4.4.死亡受體途徑

線粒體調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡可通過其他受體相關(guān)途徑放大，如Fas與其配體（Fas-L）的相互作用[36]。為了研究該肽是否啟動(dòng)了死亡受體途徑，我們進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR分析，以分析相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄（caspase-8、fas和fas-L）。10mM G（IIKK）3I-NH2處理的HeLa細(xì)胞在3至6h內(nèi)的caspase-8轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，而在孵育12h后急劇下降至正常值。fas和fas-L的轉(zhuǎn)錄遵循相同的趨勢（圖5c）。兩個(gè)基因（fas和fas-L）的高表達(dá)增加了它們相互作用的機(jī)會(huì)。這兩種分子的結(jié)合誘導(dǎo)了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）的形成，其中含有半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10[36,37]。Fas圓盤啟動(dòng)了一個(gè)反饋回路，螺旋上升，增加了線粒體促凋亡因子的釋放和caspase-8的放大激活[38]。另一方面，半胱天冬酶-8誘導(dǎo)的凋亡也可以通過刺激線粒體釋放Cyt c來放大[39]。在G（IIKK）3INH2處理的HeLa細(xì)胞中，死亡受體通路基因的高轉(zhuǎn)錄意味著該肽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也參與了死亡受體依賴的方式。

3.5.免疫效應(yīng)

從活生物體中分離的天然抗菌肽在臨床上的應(yīng)用非常有限，因?yàn)樗鼈兊纳a(chǎn)成本高、溶血性高以及可能的免疫效應(yīng)[16]。除了通過高細(xì)胞選擇性降低生產(chǎn)成本和溶血作用外，所設(shè)計(jì)的螺旋肽的非免疫效應(yīng)對于開發(fā)其潛在應(yīng)用也至關(guān)重要。兩個(gè)細(xì)胞因子基因IL2和IL8被認(rèn)為是主要的免疫系統(tǒng)信號(hào)分子，它們能夠?qū)ξ⑸锔腥咀龀龇磻?yīng)，并將外來分子（非自身）與人體自身細(xì)胞和分子（自身）區(qū)分開來[40,41]。因此，這兩個(gè)基因的高表達(dá)通常會(huì)誘發(fā)急性和慢性炎癥。因此，在用肽G（IIKK）3I-NH2處理人類淋巴細(xì)胞后，使用RT-PCR分析其細(xì)胞因子基因IL2和IL8的轉(zhuǎn)錄水平。如圖S3所示，肽培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞的IL2和IL8的相對轉(zhuǎn)錄水平低于或幾乎等于相應(yīng)對照組的水平，表明G（IIKK）3I-NH2與淋巴細(xì)胞的相互作用不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)。

3.6.體內(nèi)抗腫瘤性能

將人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于裸鼠皮下。腫瘤植入5天后，分別以1.5 mg/kg和5 mg/kg的劑量腹腔注射肽G（IIKK）3INH2和G（IIKK）4I-NH2。在給藥期間，未觀察到任何毒性跡象，如體重減輕和外觀不良（圖6b），盡管G（IIKK）4I-NH2顯示出更高的體外溶血性。與PBS中的陰性對照相比，這兩種肽對腫瘤生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中G（IIKK）4I-NH2表現(xiàn)出比G（IIKK）3I-NH2更好的療效（圖6c），這與它們的體外抗腫瘤趨勢一致。18天后，解剖腫瘤并稱重（圖6a和d）。在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下，G（IIKK）3I-NH2治療組的腫瘤生長抑制率分別為0.23和0.31。G（IIKK）4I-NH2能產(chǎn)生更有效的抑制作用，在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下，抑制率分別為0.32和0.41。這些數(shù)據(jù)表明，在小鼠異種移植模型中，螺旋肽可以有效地抑制腫瘤生長，而腫瘤細(xì)胞不能被完全清除。許多抗腫瘤藥物的不完全抑制作用已被廣泛觀察到，這可歸因于多種機(jī)制，例如藥物從腫瘤部位相對較快地清除，以及它們難以通過壞死區(qū)域擴(kuò)散[42]，但目前這組肽背后的確切原因有待進(jìn)一步的機(jī)理研究。

圖6。人宮頸癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)抗腫瘤作用。（a）給藥后解剖腫瘤。（b）給藥期間體重變化。（c）給藥期間腫瘤體積的變化。（d）給藥后的腫瘤抑制率。

4.討論

這些設(shè)計(jì)的肽短而規(guī)則。與典型的天然AMPs和流行的抗癌藥物順鉑相比，它們在抑制癌細(xì)胞生長方面的結(jié)構(gòu)簡單、效力高、副作用小，使它們成為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的理想模型和靶點(diǎn)。這些肽在界面性質(zhì)和生物活性方面表現(xiàn)出系統(tǒng)性的變化。我們面臨的直接挑戰(zhàn)是如何將分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、界面性質(zhì)和破壞細(xì)胞膜的選擇性聯(lián)系起來。這代表了功能性生物材料研究的核心努力，從而在未來肽抗生素的合理設(shè)計(jì)和對其抗腫瘤性能的理解中獲得更好的分子洞察力。

我們之前在共培養(yǎng)環(huán)境下使用NIH 3T3細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞的研究表明，這些肽對細(xì)菌和癌細(xì)胞的作用模式大致相似，并解釋了為什么它們不會(huì)對正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞造成傷害[8]。由于磷脂酰絲氨酸、O-糖基化粘蛋白、唾液化神經(jīng)節(jié)苷脂和硫酸肝素的表達(dá)升高，腫瘤細(xì)胞膜也攜帶凈負(fù)電荷。這種外膜表面的負(fù)電荷特征與細(xì)菌非常相似。這些肽和靶膜之間的靜電相互作用對選擇性反應(yīng)至關(guān)重要。

在所研究的短肽系列中，G（IIKK）3I-NH2代表了體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性方面的最佳鏈長，與之前報(bào)道的抗菌活性和選擇性觀察結(jié)果一致。已經(jīng)證明，對細(xì)菌和癌細(xì)胞的共同區(qū)別反應(yīng)源自肽通過靜電相互作用和疏水效應(yīng)之間的平衡對不同細(xì)胞膜的選擇性反應(yīng)。具體而言，負(fù)表面電荷和高度不飽和脂鏈驅(qū)動(dòng)的對癌細(xì)胞的高親和力導(dǎo)致G（IIKK）3I-NH2與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合，并隨后導(dǎo)致膜通透性。肽分子隨后通過脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)移，并積聚在癌細(xì)胞內(nèi)部。這一過程產(chǎn)生了一系列細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征，表明肽處理的癌細(xì)胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外，這項(xiàng)工作還揭示了肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡與兩個(gè)特征性的分子過程有關(guān)：線粒體途徑和死亡受體途徑。

這些肽在與淋巴細(xì)胞相互作用后不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)，重要的是，它們在裸鼠體內(nèi)對異種移植物顯示出相當(dāng)大的生長抑制作用，對宿主毒性很小，因此表明它們在臨床開發(fā)中具有巨大潛力。這些數(shù)據(jù)共同構(gòu)成了設(shè)計(jì)具有優(yōu)異生物相容性和選擇性的短肽生物材料的新范例的基礎(chǔ)。迄今為止，許多AMP通過從天然蛋白質(zhì)和肽中提取氨基酸序列來強(qiáng)調(diào)仿生作用。相比之下，在目前的工作中，我們采用了IIKK序列模塊基本單元的最小模擬，然后采用人工重復(fù)（n）和選擇性終端阻斷，從而大大提高了性能。未來的工作可以評估仿生學(xué)如何與合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相協(xié)調(diào)。目前尚不清楚一級(jí)序列的變化，例如用L、V和A替換I，或用R替換K，以及任何帶有短側(cè)鏈的非天然陽離子氨基酸，將如何改變效力和選擇性。

另一方面，雖然短肽對不同細(xì)胞類型的選擇性反應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，但細(xì)胞外膜表面精細(xì)而復(fù)雜。目前基于選擇性靜電相互作用的解釋充其量只能是一種簡化的合理化。需要進(jìn)一步研究，通過不同層次的模型界面表示來揭示詳細(xì)的分子過程，從而更直接地了解不同細(xì)胞和亞細(xì)胞界面上的不同相互作用。因此，目前的工作為探索新的科學(xué)理解開辟了一系列具有挑戰(zhàn)性但令人興奮的實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)。結(jié)合短設(shè)計(jì)功能肽開發(fā)相關(guān)的模型生物界面將促進(jìn)新的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，包括各種表面和界面成像、反射和散射，使用激光、x射線和中子束源。這些實(shí)驗(yàn)不僅將增加對生物界面過程的新理解，還將催生新技術(shù)。最后，之前的研究表明，表面活性劑樣短肽（如A9K）在抑制癌癥生長方面也表現(xiàn)出很高的效力和選擇性[11]，但這些肽促進(jìn)了水和膜樣環(huán)境下的b-折疊構(gòu)象，而不是本研究中報(bào)道的a-螺旋構(gòu)象。目前還不清楚如何不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致等效的高效力和選擇性，但具有明確的分子結(jié)構(gòu)奠定了一個(gè)有用的基礎(chǔ)，為我們探討這些重要的差異，在未來的研究。對于從事跨學(xué)科研究的物理學(xué)家和材料研究人員來說，這些合理設(shè)計(jì)的模型比已經(jīng)報(bào)道的各種天然AMP和同系物更易于處理。無論爭論的方向和結(jié)果如何，這些短肽都將引起廣泛的興趣來探索其功能用途。效力的變化有不同的含義。例如，很短的肽可以用于皮膚護(hù)理，而較長的、效力更大的肽可以用于治療開發(fā)。

5.結(jié)論

在一系列短肽G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）中，G（IIKK）3I-NH2代表了體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性方面的最佳鏈長，與之前在抗菌活性和選擇性方面的觀察結(jié)果一致。已經(jīng)證明，對細(xì)菌和癌細(xì)胞的共同鑒別反應(yīng)源于肽通過靜電相互作用和疏水效應(yīng)之間的平衡而產(chǎn)生的選擇性反應(yīng)。具體而言，負(fù)表面電荷和高不飽和脂鏈驅(qū)動(dòng)的高親和力導(dǎo)致G（IIKK）3I-NH2與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合和隨后的膜通透性。然后，肽分子通過脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)運(yùn)，并在癌細(xì)胞內(nèi)部積聚。這一過程產(chǎn)生了一系列細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征，表明肽處理的癌細(xì)胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外，這項(xiàng)工作還揭示了肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡與兩個(gè)特征性的分子過程有關(guān)：線粒體途徑和死亡受體途徑。最后，該肽在與淋巴細(xì)胞相互作用后不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)，重要的是，這些設(shè)計(jì)的肽在異種移植模型中顯示出相當(dāng)大的體內(nèi)抗腫瘤作用，而毒性很小，這兩者都表明它們作為功能材料在生物技術(shù)和臨床應(yīng)用中的潛力。

致謝

這項(xiàng)工作得到了中國國家自然科學(xué)基金資助31271497,30900765號(hào)和21033005號(hào)，山東省自然科學(xué)基金（ZR2009 9DQ00 1和JQ201105）和中央大學(xué)基礎(chǔ)研究基金（12CX04052A）的資助。我們還感謝英國工程和物理科學(xué)研究委員會(huì)（EPSRC）的支持。我們感謝英國皇家學(xué)會(huì)（倫敦）為HX提供中英獎(jiǎng)學(xué)金。