摘要

神經(jīng)元鈣傳感器-1（NCS1）屬于神經(jīng)元鈣傳感器（NCS）蛋白家族。NCS1由四個(gè)EF-手基序和一個(gè)N-末端肉豆蔻酰化組成。然而，鈣-肉豆蔻酰開關(guān)在NCS1中的存在及其在膜結(jié)合中的作用存在爭議。因此，Langmuir脂質(zhì)單層模型用于模擬細(xì)胞膜，以表征NCS1的膜相互作用。從單層測量中計(jì)算出兩個(gè)結(jié)合參數(shù)：最大插入壓力，在該壓力下蛋白質(zhì)結(jié)合是能量有利的，以及協(xié)同作用，報(bào)告與脂質(zhì)單層的吸引或排斥相互作用。在肉豆蔻?；疦CS1存在下進(jìn)行的結(jié)合膜測量顯示，由磷酸乙醇胺極性頭基和不飽和脂肪?；溄M成的磷脂具有更好的結(jié)合相互作用。在沒有鈣的情況下，膜結(jié)合測量值被徹底修改，表明蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合更牢固。事實(shí)上，NCS1的三個(gè)EFhand基序與鈣的結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化。因此，膜上的NCS1排列可以重新排列，以更好地與其基質(zhì)相互作用。NCS1的N末端肽由兩個(gè)參與NCS1膜相互作用的兩親螺旋組成。此外，肉豆蔻?；拇嬖趯CS1的膜結(jié)合有微弱的影響，表明該蛋白質(zhì)中缺乏鈣-肉豆蔻?；_關(guān)機(jī)制。因此，肉豆蔻酰化可能在NCS1的折疊/去折疊中發(fā)揮所需的結(jié)構(gòu)作用，這對其多種生物學(xué)功能至關(guān)重要。

1、引言

鈣信號在細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。事實(shí)上，鈣是一種細(xì)胞內(nèi)信使，參與多種生物過程，如神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)傳遞[4-7]。細(xì)胞對鈣反應(yīng)的多樣性由一個(gè)EF-hand鈣結(jié)合蛋白家族提供，包括神經(jīng)元鈣傳感器（NCS）蛋白亞家族[8-10]。NCS家族有14個(gè)成員，由四個(gè)EF-手基序（兩個(gè)由短環(huán)區(qū)連接的螺旋）和一個(gè)N-末端肉豆蔻?；沧R序列組成。

在NCS家族的蛋白質(zhì)中，神經(jīng)鈣傳感器-1（NCS1）在大多數(shù)神經(jīng)元類型以及發(fā)育中的心肌細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)[11-13]。NCS1主要定位于細(xì)胞膜，參與多種功能，如促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放[14-17]，調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇4-激酶[18-21]的脂質(zhì)激酶活性和調(diào)節(jié)鉀通道[22]。NCS1是一種22 kDa肉豆蔻?；鞍?，具有四個(gè)EF-手基序，其中EF1是隱蔽的，因此不與鈣結(jié)合。之前已經(jīng)確定了鈣存在下非肉豆蔻?；疦CS1的三維結(jié)構(gòu)（圖S1）[23]。EF-hands 1-3的鈣結(jié)合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，導(dǎo)致C-末端片段的擠出和大的疏水裂縫的暴露[23,24]。這種構(gòu)象變化允許蛋白質(zhì)通過其疏水裂縫結(jié)合多種底物[25-29]。

鈣-肉豆蔻基開關(guān)是一種分子調(diào)節(jié)機(jī)制，導(dǎo)致肉豆蔻基在鈣存在的情況下從疏水裂縫中擠出[30-35]。鈣-肉豆蔻酰開關(guān)的存在已被證明存在于幾種NCS蛋白質(zhì)中，如recoverin、VILIP-1、VILIP-3和hippocalcin。然而，存在鈣的非肉豆蔻?；疦CS1的三維結(jié)構(gòu)不允許確認(rèn)這種機(jī)制的存在[23]。此外，在NCS1中存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)是有爭議的。核磁共振（NMR）、熒光和平衡鈣結(jié)合測量表明，芽殖酵母的NCS1同系物（Frq1）可能具有鈣-肉豆蔻酰開關(guān)[36]。這一建議得到了裂變酵母（NCS1）NCS1同系物核磁共振結(jié)構(gòu)測定的支持[28]。事實(shí)上，Ncs1十四烷基在沒有鈣的情況下被埋入空腔中，在有鈣的情況下被擠出。然而，NCS1、NCS1和Frq1的序列不相似，可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)差異（圖1）。事實(shí)上，分裂酵母Ncs1和芽殖酵母Frq1與哺乳動物Ncs1的同源性分別為69.5%和60.0%。此外，結(jié)構(gòu)分析允許識別NCS1 N-末端段內(nèi)6個(gè)殘基的基序，即使在沒有鈣的情況下，這些基序也將肉豆蔻?；i定在暴露的構(gòu)象中[29]。這6個(gè)殘基基基序（圖1中以紅色突出顯示）對于每個(gè)物種都非常不同。這種差異可以解釋Frq1和Ncs1存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)，這與它們的人類同源物Ncs1不同。NCS1功能的模型強(qiáng)調(diào)了與鈣的存在無關(guān)的本構(gòu)膜結(jié)合[37]。此外，鈣在體外和神經(jīng)細(xì)胞系中的膜結(jié)合不需要鈣，這表明缺乏鈣-肉豆蔻酰開關(guān)[37,38]。其他出版物使用這些不同的結(jié)果來證實(shí)或否認(rèn)NCS1中存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)[10,27,39-41]。盡管對NCS1進(jìn)行了大量研究，但鈣-肉豆蔻酰開關(guān)的存在仍有疑問，其確切機(jī)制尚待確定。

圖1.人類NCS1（橙色）、裂變酵母NCS1（粉紅色）和芽殖酵母Frq1（藍(lán)色）的序列比對。在鈣存在和不存在的情況下，負(fù)責(zé)肉豆蔻基擠出的基序用紅色表示[29]（為了解釋本圖例中對顏色的引用，讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本）。

本出版物旨在研究在鈣及其肉豆蔻酰基存在和不存在的情況下NCS1的膜結(jié)合，以解決當(dāng)前的爭議。此外，關(guān)于NCS1膜結(jié)合的信息很少。核磁共振分配表明，在膜存在和不存在的情況下，NCS1發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[42]。此外，對兩種不同的脂質(zhì)囊泡（棕櫚酰油酰基磷酸絲氨酸POPS和棕櫚酰油?；姿崮憠APOPS）進(jìn)行了熒光測量，表明NCS1以鈣依賴性方式結(jié)合POPS囊泡[24]。最后，免疫細(xì)胞化學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在Triton X-100提取后獲得的耐去污膜（DRM）中發(fā)現(xiàn)少量NCS1[43]。然而，磷脂的組成對NCS1的膜結(jié)合的影響尚未描述。在本出版物中，Langmuir脂質(zhì)單層模型用于模擬細(xì)胞膜，并確定幾種條件下NCS1的膜結(jié)合參數(shù)。

首先，研究了肉豆蔻?；疦CS1（mNCS1）在具有不同磷脂單分子膜的鈣存在下的膜結(jié)合行為。這些數(shù)據(jù)可以表征磷脂成分對蛋白質(zhì)結(jié)合的影響。然后在沒有鈣的情況下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，以了解構(gòu)象變化對其結(jié)合的影響。然后研究了非肉豆蔻酰化NCS1（nmNCS1）的行為，以突出肉豆蔻?；鶊F(tuán)在存在或不存在鈣的情況下的作用。最后，使用一種類似于NCS1 N末端片段的肽來更好地了解其在蛋白質(zhì)膜結(jié)合中的作用。

2、材料和方法

2.1.布料

用于制備緩沖溶液的去離子水來自Barnstead Nanopure系統(tǒng)（Barnstead，Dubuque，IA）。其電阻率和表面張力在20?C分別為18.2 M×cm和72 mN/M。磷脂來自Avanti極性脂質(zhì)（Alabaster，Al）：二棕櫚酰膽堿（DPPC）、二硬脂酰膽堿（DSPC）、二油酰膽堿（DOPC）、二氧羰基六烯醇磷酸膽堿（DDPC）、二棕櫚酰磷酸乙醇胺（DPPE）、二硬脂酰磷酸乙醇胺（DSPE）、二油酰磷酸乙醇胺（DOPE），雙二十二碳六烯基磷酸乙醇胺（DDPE）、二棕櫚酰磷酸絲氨酸（DPPS）、二硬脂酰磷酸絲氨酸（DSPS）、二油酰磷酸絲氨酸（DOPS）和雙二十二碳六烯基磷酸絲氨酸（DDPS）。CaCl2、Hepes和巰基乙醇來自西格瑪（密蘇里州圣路易斯）。KCl和EGTA來自實(shí)驗(yàn)室Mat（魁北克，QC）。由DO和DD?；溄M成的溶液在氯仿中以0.1 mg/mL的濃度制備，并在氬氣下儲存，在5.5 mg/mL的抗氧化劑BHT存在下?20?C、所有其他化學(xué)品均按收到時(shí)使用。

2.2.NCS1的表達(dá)和純化

mNCS1和nmNCS1如前所述過表達(dá)和純化[44,45]。使用標(biāo)準(zhǔn)9-芴甲氧基羰基/二丙基碳二亞胺（Fmoc/DIC）化學(xué)[46]通過固相程序合成N-末端肽。在合成的最后一步，使用肉豆蔻酸酐和標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序[46]對N-末端甘氨酸進(jìn)行肉豆蔻?；?

2.3.結(jié)合參數(shù)的測量

使用DeltaPi4微張力計(jì)和Kibron Inc.（芬蘭赫爾辛基）的500L玻璃槽（2 cm2），通過Wilhelmy方法測量表面壓力（）。在每次實(shí)驗(yàn)之前，用自來水沖洗玻璃槽，然后在乙醇存在下用Q-Tip刷洗。在用去離子水進(jìn)行大量沖洗之前，這些清洗重復(fù)3次。然后通過表面抽吸干燥槽。實(shí)驗(yàn)裝置放置在21±1的有機(jī)玻璃箱內(nèi)?C帶濕度控制。亞相緩沖液包含50 mM Hepes、3 mM巰基乙醇、50 mM KCl和pH 7.2下的1 mM CaCl2或5 mM EGTA。

將幾微升溶解在氯仿（1 mg mL）中的磷脂分散成磷脂單層?1）直到達(dá)到所需的初始表面壓力（i）。攤鋪溶劑蒸發(fā)和薄膜達(dá)到平衡的等待時(shí)間隨脂質(zhì)類型、攤鋪體積、初始表面壓力和脂質(zhì)濃度而變化[47]。然后將NCS1注入該單層下方，以達(dá)到274nm的最佳最終濃度。監(jiān)測蛋白質(zhì)與磷脂單層結(jié)合的動力學(xué)，直到在不攪拌的情況下（通常為3小時(shí)）達(dá)到平衡表面壓力（e）。注入NCS1后測得的表面壓力增加（）對應(yīng)于e–i。

結(jié)合參數(shù)的計(jì)算如前所述[47,48]。簡而言之，在脂質(zhì)單層的不同i值下進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)合測量。然后，作為i函數(shù)的圖允許通過將圖的回歸外推到x軸來確定最大插入壓力（MIP）。MIP的不確定性是根據(jù)前面描述的線性回歸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的協(xié)方差計(jì)算的[48]。事實(shí)上，這種不確定性已確定如下：回歸y=ax+b可以從的圖中獲得，作為i的函數(shù)。MIP在y=0時(shí)計(jì)算。因此，x=?b/a或i=?b/a.因此，置信區(qū)間（CI）由以下公式得出：95%CI=i±1.96 Var（i），其中1.96的值來自95%置信區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)（z）分布表中的z值。Var（i）由delta方法確定，使用，

其中，Var（a）和Var（b）由標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）的平方獲得，例如Var（a）=SE（a）2。使用SPSS軟件計(jì)算a和b的SE。Cov（a，b）通過使用，

其中′x是i的平均值，而是使用SPSS軟件獲得的剩余平均值。協(xié)同值對應(yīng)于圖e的線性回歸斜率，作為圖i的函數(shù)[47]。也可以通過將的線性回歸斜率加1作為i的函數(shù)來獲得[49]。使用（（e）（1）計(jì)算協(xié)同效應(yīng)的不確定性?r2）1/2）/（（i）（n）?2）1/2），其中是標(biāo)準(zhǔn)差，r是相關(guān)系數(shù)，n是點(diǎn)數(shù)。我們最近創(chuàng)建了一個(gè)免費(fèi)的網(wǎng)頁，在那里可以很容易地計(jì)算這些綁定參數(shù)和實(shí)驗(yàn)誤差(/http://www.crchudequebec.ulaval.ca/BindingParametersCalculator/）。

使用以下適用于Pitcher等人[50]測量的表面壓力的拉伸指數(shù)方程擬合蛋白質(zhì)或肽在磷脂單分子膜上吸附期間記錄的表面壓力與時(shí)間的值：?ie?（kt）ˉ，其中t是時(shí)間t時(shí)單層的表面壓力，k是速率系數(shù)，t是時(shí)間，ˉ是固定為0.001的指數(shù)比例因子。

結(jié)果和討論

3.1.mNCS1的膜結(jié)合

細(xì)胞膜是復(fù)雜的脂質(zhì)雙層，在一些生物過程中起著至關(guān)重要的作用。此外，大約25%的整個(gè)蛋白質(zhì)組與這些膜動態(tài)相互作用，并參與其不同的功能[51,52]。Langmuir脂質(zhì)單層是一種巧妙的模型膜系統(tǒng)，用于研究空氣/水界面的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用[48,53-56]。此外，雙層和單層之間存在直接熱力學(xué)關(guān)系[57,58]。該模型可以通過控制不同參數(shù)（如表面壓力）來表征蛋白質(zhì)吸附和脂質(zhì)特異性。如第2.3節(jié)所述，最大插入壓力（MIP）和協(xié)同作用是兩個(gè)結(jié)合參數(shù)，可以通過單層測量計(jì)算。MIP值是蛋白質(zhì)結(jié)合能量有利的最大表面壓力。負(fù)協(xié)同值表示蛋白質(zhì)與磷脂單層的不利結(jié)合，而正協(xié)同值表示有利結(jié)合[47]。事實(shí)上，該參數(shù)與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)單層之間的協(xié)同作用有關(guān)。在有鈣和無鈣的情況下，計(jì)算了mNCS1的這兩個(gè)參數(shù)，以表征mNCS1的膜結(jié)合以及該離子對其結(jié)合的影響。

3.1.1.鈣存在下mNCS1的膜結(jié)合

為了在每次實(shí)驗(yàn)中獲得最佳且可重復(fù)的表面壓力變化，蛋白質(zhì)的量必須使脂質(zhì)單層飽和。因此，在朗繆爾槽中注入了幾種濃度的NCS1。平衡時(shí)的表面壓力值在274 nM的濃度下達(dá)到平臺（圖S2）。該飽和濃度用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

NCS1主要表達(dá)于神經(jīng)元、肥大細(xì)胞和心肌細(xì)胞[11-13]。神經(jīng)元膜由51 mol%的磷酸膽堿（PC）、29 mol%的磷酸乙醇胺（PE）和5 mol%的磷酸絲氨酸（PS）組成[59]。類似地，肥大細(xì)胞膜由50 mol%PC、25 mol%PE和15 mol%PS組成[60]。此外，心肌細(xì)胞膜由23 mol%PC、41 mol%PE和8 mol%PS組成[61]。PE是一個(gè)較小的兩性離子極性頭基團(tuán)，而PC是一個(gè)較大的（圖S3）。PS也比PE大，帶負(fù)電。這三個(gè)最具代表性的極性頭基團(tuán)已用于存在不同脂肪酰基鏈的情況下，以評估脂質(zhì)成分對NCS1膜結(jié)合的影響。事實(shí)上，已經(jīng)選擇了四個(gè)脂肪?；湥ǘ貦磅P、二硬脂酰DS、二油?；鵇O和二羰基六烯基DD）（圖S3）。細(xì)胞膜主要由這四條脂肪?；溄M成，這四條脂肪?；溚ǔＵ伎傊觉；湹?0%以上。例如，心肌細(xì)胞膜由14 mol%DS、27 mol%DP、16 mol%DO和5 mol%DD組成，帶有PE極性頭群[61]。DP和DS分別是由16個(gè)和18個(gè)碳組成的飽和脂肪?；湣O和DD分別是由18個(gè)和22個(gè)碳組成的不飽和脂肪?；湣O只有一個(gè)不飽和（雙鍵），而DD有6個(gè)不飽和。這些組成差異會導(dǎo)致幾種物理狀態(tài)（液體膨脹、液體冷凝或固體冷凝），這些物理狀態(tài)會影響蛋白質(zhì)的膜結(jié)合[49]。此外，細(xì)胞膜的脂質(zhì)在大多數(shù)細(xì)胞器（包括質(zhì)膜）的膜中不對稱分布（見參考文獻(xiàn)[62]）。因此，Langmuir脂質(zhì)單層模型允許獨(dú)立測定蛋白質(zhì)與外膜或內(nèi)膜小葉中脂質(zhì)的結(jié)合。因此，在鈣存在的12種不同磷脂單分子膜下注射了mNCS1。

確定綁定參數(shù)的典型示例如圖2所示。實(shí)際上，對于6.0、8.0、16.2和24.2 mN/m的i，分別獲得了21.0、19.0、12.9和8.0 mN/m的（圖2插圖）。被繪制為i的函數(shù)，導(dǎo)致負(fù)斜率。因此，在DPPE存在的情況下，mNCS1的MIP值為35.8±1.1 mN/m，協(xié)同值為0.30±0.02。這種積極的協(xié)同作用表明mNCS1和這種脂質(zhì)單層之間發(fā)生了積極的相互作用。然后，以不同的i注射每種脂質(zhì)和MIP，并根據(jù)表面壓力動力學(xué)計(jì)算協(xié)同值。

圖2.在鈣存在下測定mNCS1與DPPE單層結(jié)合參數(shù)的典型示例。最大插入壓力（MIP）通過外推圖作為初始表面壓力（i）的函數(shù)來確定，其中曲線在x軸上達(dá)到0值。通過在該圖的斜率上添加一個(gè)來計(jì)算協(xié)同效應(yīng)。插圖：mNCS1在6.0、8.0、16.2和24.2 mN/m的不同i下與DPPE單層的典型結(jié)合動力學(xué)，作為達(dá)到平衡（e）的時(shí)間函數(shù)（為清楚起見，僅顯示了一些動力學(xué)）。從表面壓力的增加（–i）中減去初始表面壓力，并繪制為時(shí)間的函數(shù)。

圖3比較了含12種不同磷脂的mNCS1的MIP值和協(xié)同值（數(shù)值見表S1）。膜側(cè)壓力的估計(jì)范圍為30–35 mN/m[63–70]。因此，可以假設(shè)低于下限的MIP（30 mN/m）表明蛋白質(zhì)不會穿透細(xì)胞膜。然而，MIP大于下限將表明蛋白質(zhì)將能夠廣泛滲透到生物膜中。用PS和PC脂質(zhì)單層觀察到的所有MIP值均低于估計(jì)的膜側(cè)壓力下限(～30 mN/m），DOP除外。然而，在PE脂質(zhì)單層中觀察到的MIP值大于或等于30 mN/m。這些數(shù)據(jù)表明，mNCS1可能與由PE組成的膜結(jié)構(gòu)域在生理上相互作用，與由PC和PS組成的結(jié)構(gòu)域不同。在mNCS1中觀察到的協(xié)同值證實(shí)了這一趨勢。事實(shí)上，PE脂質(zhì)單分子膜的協(xié)同值大于PS和PC脂質(zhì)單分子膜的協(xié)同值，DO脂肪?；湷?。此外，與四種PE脂質(zhì)單分子膜觀察到的協(xié)同值相當(dāng)高。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了mNCS1對PE脂質(zhì)單分子膜更好的結(jié)合作用。這種趨勢可以用PE特性來解釋，PE特性是一種廣泛存在于神經(jīng)元膜中的兩性離子極性頭群[59]。事實(shí)上，其弱位阻可以允許mNCS1插入脂肪?；湥还苤觉；溔绾巍?

圖3.在鈣存在下，使用DPP、DSP、DOPS、DDPS、DPPC、DSPC、DOPC、DDC、DDPC、DPPE、DSPE、DOPE、DOPE和DDPE單層的mNCS1的MIP（A）和協(xié)同（B）值。MIP和synergy值的不確定性如第2.3節(jié)所述計(jì)算。

在DPP和DPPC單分子膜的存在下觀察到負(fù)協(xié)同值，表明NCS1與這些脂質(zhì)的結(jié)合不利。此外，提及排除壓力比提及aMIP更合適。實(shí)際上，協(xié)同作用小于0時(shí)獲得的MIP可以稱為“排斥壓力”，因?yàn)樗鼘?yīng)于蛋白質(zhì)和單層之間的排斥。在DPP存在下觀察到的強(qiáng)排斥（協(xié)同作用?0.12±0.07）可以用mNCS1的電荷分布來解釋（圖4）。事實(shí)上，將與單分子膜相互作用的片段可能帶負(fù)電，因此由于PS極性頭基團(tuán)的負(fù)電荷而被靜電斥力延遲。然后，分布在整個(gè)蛋白質(zhì)中的多個(gè)負(fù)電荷可能在蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合和定向中發(fā)揮作用。相反，PC極性頭基是兩性離子，但具有很強(qiáng)的空間位阻。這種構(gòu)象可以解釋MIP的低值，在這種極性頭部基團(tuán)中低于30 mN/m，因此mNCS1結(jié)合PC脂質(zhì)單分子膜的能力降低。

圖4.nmNCS1結(jié)構(gòu)上的正（紅色）和負(fù)（藍(lán)色）電荷（PDB 2LCP）[23]（關(guān)于此圖例中顏色的說明，讀者請參閱本文的web版本）。