2結(jié)果與分析

2.1β-乳球蛋白納米纖維形成動力學

圖1加熱不同時間的β-乳球蛋白納米纖維的ThT熒光強度

ThT熒光染色法是檢測蛋白質(zhì)纖維化的典型方法。ThT通過與蛋白質(zhì)纖維中β-折疊結(jié)構的特異性結(jié)合而具有特定的熒光行為。該方法可以檢測β-折疊結(jié)構的變化從而獲得纖維化程度的信息，即形成的蛋白質(zhì)纖維的數(shù)量。ThT熒光強度越強，意味著形成的蛋白質(zhì)纖維越多。從圖1可以看出，熒光強度隨著加熱時間延長逐漸增加。在熱處理的前4 h內(nèi)熒光強度的增加較為緩慢，隨后則快速增加。大約10 h后，曲線出現(xiàn)平臺區(qū)，熒光強度值保持相對穩(wěn)定，意味著蛋白質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變已經(jīng)完成。本實驗觀察到的現(xiàn)象與其他蛋白質(zhì)相關現(xiàn)象類似。

2.2β-乳球蛋白纖維聚集體形成過程中的形貌變化

如圖2所示，在開始階段（圖2A），β-乳球蛋白呈現(xiàn)出均勻球狀，粒徑約為30～40 nm，分散良好。加熱0.5 h后（圖2B）可觀察到球狀蛋白粒徑開始減小，而分布更加密集，可能由于蛋白質(zhì)的水解導致。直到加熱2 h后（圖2D），開始出現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)納米纖維，但纖維數(shù)量較少。進一步加熱會導致纖維數(shù)量增加，直徑變粗（圖2E、F）。Mezzenga等研究了纖維的形成機理及過程，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子在反應初始階段發(fā)生水解，然后部分以β-折疊結(jié)構為主的片段在靜電排斥力和疏水相互作用的平衡下進行有序聚集，即自組裝作用，形成纖維狀聚集物。一旦纖維開始形成，其生長的進程快且雙向進行，最后形成具有長直結(jié)構的蛋白質(zhì)纖維。從圖2可以得出，在蛋白質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變的不同階段，其產(chǎn)物的組成、形貌是不同的，意味著其界面性質(zhì)的差異。

圖2加熱不同時間形成的β-乳球蛋白納米纖維的透射電子顯微鏡圖

2.3纖維化過程中β-乳球蛋白界面性質(zhì)的變化

圖3纖維化過程中β-乳球蛋白在油水界面的吸附動力學過程（A）及其飽和界面張力（B）的變化

乳液的形成及穩(wěn)定性決定于界面物質(zhì)的吸附行為和界面膜的黏彈模量。采用懸滴法對β-乳球蛋白纖維化轉(zhuǎn)變過程中不同階段產(chǎn)物的界面吸附動力學過程和界面膜的黏彈模量進行研究。圖3A為各階段產(chǎn)物在油-水界面的界面張力隨時間的變化?？梢杂^察到，所有樣品的界面張力隨吸附時間逐漸上升，意味著不同階段產(chǎn)物均具有界面吸附行為。一段時間后界面張力上升速度趨于平緩，表明物質(zhì)在界面上的吸附逐漸達到飽和。從圖3B可以發(fā)現(xiàn)，纖維化轉(zhuǎn)變不同階段的產(chǎn)物，其平衡界面張力存在區(qū)別。在開始階段，飽和界面張力隨蛋白加熱時間的延長而升高，當加熱時間超過2 h后，飽和界面張力的變化不再明顯。綜合上述分析可以看出，在熱處理的初始階段，蛋白質(zhì)發(fā)生了水解，這一現(xiàn)象使得蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變小，而擴散速度增加，因而相對未水解的蛋白能達到更高的飽和界面張力。盡管過度水解會導致蛋白質(zhì)界面活性的破壞，但后期隨著納米纖維的形成，混合體系的整體界面活性仍然能保持較高水平。

圖4纖維化過程中β-乳球蛋白在油/水界面的擴張流變學特性

如圖4A所示，隨著蛋白不斷吸附到油-水界面上（界面張力的增加），樣品的黏彈模量也不斷增加，說明不同纖維化階段的產(chǎn)物在油/水界面存在明顯相互作用，使得界面層具有較強的黏彈性。同時隨著纖維化轉(zhuǎn)變的進行（加熱時間的延長），其界面黏彈模量逐漸升高，說明纖維化轉(zhuǎn)變有利于界面吸附層的黏彈性的提高。如圖4B所示，隨著纖維化轉(zhuǎn)變的進行，其飽和模量不斷升高，但在不同階段，其變化幅度不同。即在纖維化的初始階段上升較快，而后期則上升不明顯，這表示纖維化轉(zhuǎn)變的完成，體系中纖維的數(shù)量增加不再明顯，體系的界面黏彈模量的變化趨于平緩。蛋白質(zhì)納米纖維屬于形狀各向異性材料，其在油/水界面上的相互作用不同于一般的球形顆?；蛉嵝愿叻肿?，具有更強的相互作用，因而能產(chǎn)生更高的界面黏彈性。食品油/水界面或氣/水界面的穩(wěn)定依賴于界面膜的強度，即黏彈模量。目前食品行業(yè)大多數(shù)采用的吐溫、蔗糖酯等小分子表面活性劑所形成的界面膜通常較弱，在食品儲藏過程中容易使界面失穩(wěn)，從而導致食品結(jié)構的破壞（如奶油的乳析、植脂末的滲油等）。蛋白質(zhì)纖維聚集體所表現(xiàn)出的高界面強度則有助于上述問題的解決。

2.4纖維化過程對β-乳球蛋白乳化性的影響

圖5纖維化轉(zhuǎn)變過程中β-乳球蛋白納米纖維穩(wěn)定的乳液外觀（A）、平均粒徑（B）和常溫貯藏時粒徑（C）的變化

從圖5A可以看出，纖維化的各個階段的產(chǎn)物均能形成較為穩(wěn)定的油/水乳液，并且隨著纖維化程度提高，乳液中乳化層的厚度增加，意味著纖維化產(chǎn)物的乳化能力的提高。通過乳液的平均粒徑（圖5B）可以看出，乳液的粒徑隨著纖維化程度的提高而逐漸減小，直至纖維化轉(zhuǎn)變2 h后，其產(chǎn)物形成的乳液粒徑趨于穩(wěn)定，說明其乳化能力的變化不再明顯，與圖5A圖現(xiàn)象一致。如圖5C所示，隨著儲藏時間的延長，乳液的粒徑均有所上升，這是由于乳液在儲藏過程中乳滴之間發(fā)生了一定程度的絮凝或聚集。絮凝主要由于乳滴之間的靜電排斥力所致，而聚集則由于乳滴表面的界面強度不足所致。比較不同樣品在30 d儲藏過程中的粒徑變化發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)化的蛋白乳液平均粒徑增加了1.907μm，而纖維化0.5～12 h的蛋白，其乳液的平均粒徑分別增加了0.63μm（0.5 h），1.08μm（1 h），1.09μm（2 h），3.00μm（5 h），2.80μm（7 h）和3.20μm（12 h）。由此可見，纖維化0.5 h的乳液相對最為穩(wěn)定，未經(jīng)纖維化轉(zhuǎn)變或過長時間的纖維化轉(zhuǎn)變均不利于乳液的穩(wěn)定性。纖維化轉(zhuǎn)變后，柔性蛋白分子轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢▌傂缘睦w維聚集體，該聚集體相對于蛋白分子具有更高的界面吸附能，從而提高了乳液的穩(wěn)定性。而長時間的纖維化所導致的乳液穩(wěn)定性下降，可能由于連續(xù)相中的纖維產(chǎn)生的耗散性絮凝所導致。在實際應用中，乳化能力和乳化穩(wěn)定性需要同時考慮。較高的乳化能力有助于形成粒徑較小的乳滴，而乳化穩(wěn)定性有助于乳液保持長期的穩(wěn)定性。綜合比較，纖維化2 h的蛋白質(zhì)較適宜于在食品乳化中的應用。

3結(jié)論

本實驗對β-乳球蛋白在纖維化轉(zhuǎn)變不同階段的產(chǎn)物進行了表征，并對其界面及乳化行為進行了分析研究。在纖維化轉(zhuǎn)變初期，蛋白質(zhì)發(fā)生水解，2 h后開始形成少量纖維。隨時間延長纖維數(shù)量則開始增加，直徑變粗。通過對界面吸附行為和界面流變性分析可知，β-乳球蛋白的纖維化轉(zhuǎn)變可有效提高其界面活性，且增強了界面上蛋白分子間的相互作用。通過乳化實驗，發(fā)現(xiàn)隨著纖維化轉(zhuǎn)變過程的延長，其產(chǎn)物的乳化能力逐漸提高，但乳化穩(wěn)定性在開始階段有所提高，后期逐漸下降。綜合比較，纖維化2 h的產(chǎn)物最適宜用于食品的乳化。