摘要：為了研究胞質(zhì)分裂過(guò)程中子細(xì)胞表面張力與細(xì)胞間橋變形之間的聯(lián)系，采用微管吸吮實(shí)驗(yàn)測(cè)定了正常大鼠腎上皮細(xì)胞(NRK)在細(xì)胞松弛素D(即CD)或blebbistatin作用下細(xì)胞表面張力的變化，并且采用局部施加CD的方法分析了兩極子細(xì)胞表面張力非平衡狀態(tài)下細(xì)胞間橋的變形曲線。研究結(jié)果認(rèn)為，CD和blebbistatin均可以大幅降低細(xì)胞表面張力；整體施加blebbistatin抑制細(xì)胞主動(dòng)性收縮會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間橋變形完全受到子細(xì)胞表面張力的調(diào)控，細(xì)胞間橋變形過(guò)程反映出細(xì)胞調(diào)節(jié)整體表面張力的進(jìn)程。

動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)分裂過(guò)程伴隨一系列精巧而又相對(duì)簡(jiǎn)單的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。首先，細(xì)胞變圓拉長(zhǎng)；隨后在赤道板形成分裂溝并開(kāi)始收縮，兩極子細(xì)胞中間出現(xiàn)細(xì)胞間橋；最后，細(xì)胞間橋變細(xì)、斷裂，生成兩個(gè)子細(xì)胞。胞質(zhì)分裂是一個(gè)典型的力學(xué)變形過(guò)程，與細(xì)胞皮層力學(xué)特性的改變關(guān)系緊密，細(xì)胞間橋變形的過(guò)程由分裂溝主動(dòng)收縮和細(xì)胞各部分表面張力協(xié)調(diào)控制。

細(xì)胞表面張力是細(xì)胞皮層力學(xué)的一個(gè)重要參數(shù)，可能是肌動(dòng)—肌球蛋白相互作用的結(jié)果。研究表明：完整的肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)對(duì)于張力的產(chǎn)生必不可少，肌球蛋白II突變的黏菌細(xì)胞表面張力較正常黏菌細(xì)胞降低70%。因此，細(xì)胞表面張力成為衡量肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白動(dòng)力學(xué)變化的一個(gè)重要指標(biāo)，例如肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的濃度分布，肌動(dòng)蛋白纖維排列以及肌球蛋白輕鏈磷酸化激活等。胞質(zhì)分裂過(guò)程中，極區(qū)子細(xì)胞的表面張力與細(xì)胞間橋變形的聯(lián)系是胞質(zhì)分裂動(dòng)力學(xué)的重要研究對(duì)象，對(duì)探索胞質(zhì)分裂的機(jī)制具有積極作用。

本文利用雙微管局部加藥手段通過(guò)施加細(xì)胞松弛素D抑制單側(cè)極區(qū)子細(xì)胞皮層肌動(dòng)蛋白的裝配從而改變子細(xì)胞表面張力。實(shí)驗(yàn)中采用肌球蛋白II的ATP酶活性抑制劑blebbistatin抑制細(xì)胞的主性動(dòng)收縮，在對(duì)比不同驅(qū)動(dòng)力作用下細(xì)胞分裂溝間橋變形的基礎(chǔ)上，分析了極區(qū)皮層表面張力在不同收縮力狀態(tài)下對(duì)變形過(guò)程調(diào)控的差異。通過(guò)細(xì)胞間橋變形的趨勢(shì)，研究和分析了子細(xì)胞表面張力與胞質(zhì)分裂細(xì)胞間橋變形的聯(lián)系。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

正常大鼠腎上皮細(xì)胞(Normal rat kidney epithelial cells，以下簡(jiǎn)稱(chēng)NRK)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)中，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清(四季青公司)。在體積分?jǐn)?shù)5%的CO?、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，待用。

1.2整體和局部抑制劑處理

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK細(xì)胞經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化5 min后輕輕吹打至懸浮。分別采用抑制肌動(dòng)蛋白聚合的2μmol/L CD、抑制肌球蛋白II的ATP酶活性抑制劑30μmol/L blebbistatin處理細(xì)胞15 min。用沒(méi)有加入骨架蛋白抑制劑的細(xì)胞作為對(duì)照組。

先將(—)-blebbistain對(duì)映體(Sigma公司)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配置成10 mmol/L的blebbistatin溶液，再加入三蒸水配成5 mmol/L儲(chǔ)存液，—20℃保存。使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋至終濃度為30μmol/L，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.3%的DMSO。利用blebbistatin處理細(xì)胞15～20 min后開(kāi)始局部施加抑制劑。將CD(Sigma公司)配成100μmol/L的儲(chǔ)存液，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.5%的DMSO，—20℃保存。使用時(shí)用含0.5 g/L羅丹明熒光素(Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)褂脻舛葹?μmol/L，約含體積分?jǐn)?shù)0.02%的DMSO。

將抑制劑注入加藥微管，加藥微管直徑約3μm，吸藥管直徑約30μm，兩管相距約30μm。通過(guò)氣泵調(diào)節(jié)壓力，控制藥物作用范圍直徑約15μm。加藥管靠近子細(xì)胞一端極區(qū)，以避免加入的抑制劑流入分裂溝處。加入CD的范圍和濃度變化可以通過(guò)羅丹明熒光素顯示，熒光強(qiáng)度的變化代表抑制劑作用濃度梯度，施加的抑制劑在距離中心15μm以外的范圍濃度很低，見(jiàn)圖1。

圖1局部施加抑制劑的范圍和濃度變化

1.3細(xì)胞表面張力的測(cè)定

采用芬蘭Kibron公司生產(chǎn)的Delta-8全自動(dòng)高通量表面張力儀對(duì)細(xì)胞膜表面張力進(jìn)行間接評(píng)估。該儀器基于朗繆爾單層原理，通過(guò)測(cè)量氣液界面吸附膜的平衡表面壓力來(lái)反映膜材料的表面張力特性。

樣品準(zhǔn)備與測(cè)量：

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌兩次。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度，制備成單細(xì)胞懸液。將含有細(xì)胞骨架蛋白抑制劑（CD、blebbistatin或其組合）的處理組細(xì)胞懸液及未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞懸液分別上樣至儀器樣品板。

測(cè)量過(guò)程：

儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)氣液界面的表面壓力變化。細(xì)胞在界面處發(fā)生吸附并形成單層膜，其膜脂與皮層蛋白的力學(xué)特性會(huì)影響界面的平衡表面壓力（π平衡）。細(xì)胞膜的表面張力（γ細(xì)胞膜）可通過(guò)公式γ細(xì)胞膜=γ_0-π平衡進(jìn)行估算，其中γ_0為純培養(yǎng)基的表面張力（約為72 mN/m）。儀器自動(dòng)記錄達(dá)到平衡后的表面壓力值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少6次。

1.4細(xì)胞間橋的測(cè)量和細(xì)胞間橋動(dòng)力學(xué)模型

定義間橋直徑與間橋長(zhǎng)度相等時(shí)刻的相對(duì)直徑為1，其它各時(shí)刻的相對(duì)直徑等于各時(shí)間點(diǎn)間橋直徑與上述直徑絕對(duì)值的比，對(duì)間橋直徑進(jìn)行無(wú)量綱化。規(guī)定間橋直徑與間橋長(zhǎng)度相等時(shí)的時(shí)刻為0 s，則所有曲線均過(guò)(0,1)點(diǎn)，定義(0,1)點(diǎn)為D?(見(jiàn)圖2)，使曲線更具有直觀性和可比性。對(duì)表觀速度進(jìn)行如下規(guī)定：D?之前的表觀速度為間橋直徑在-200~0 s時(shí)間段的速度；D?之后的表觀速度為間橋直徑在0～200 s時(shí)間段的速度。

圖2 NRK細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)隨時(shí)間變化曲線

實(shí)驗(yàn)采用間橋變細(xì)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)間橋變形進(jìn)行分析和模擬，見(jiàn)圖3。該模型認(rèn)為：肌球蛋白II所產(chǎn)生的徑向應(yīng)力為主動(dòng)力，促進(jìn)胞漿從間橋向兩個(gè)子細(xì)胞流動(dòng)；間橋末端以及子細(xì)胞胞漿黏性產(chǎn)生的軸向應(yīng)力為被動(dòng)力，阻礙胞漿從間橋向兩個(gè)子細(xì)胞流動(dòng)。間橋半徑隨時(shí)間變化的函數(shù)表達(dá)式為：

1.5數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用微管吸吮測(cè)量細(xì)胞表面張力，采用100倍物鏡，10倍目鏡；對(duì)細(xì)胞形態(tài)變形進(jìn)行測(cè)量實(shí)驗(yàn)，采用40倍物鏡，10倍目鏡，兩者均通過(guò)中繼放大50%。圖像采集均通過(guò)冷CCD(DP71，Olympus)進(jìn)行圖像采集，間隔4 s取像。采用圖像處理軟件(Image Pro 5.1，Olympus)進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量。不同細(xì)胞組數(shù)據(jù)用OriginPro 8.0處理，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件及方差分析比較組間差異，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。