結(jié)果和討論

槐脂（SLs）相對(duì)較大的生產(chǎn)能力、可再生性和“生態(tài)友好性”有助于提高其作為家庭和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中某些石化表面活性劑的添加劑或替代品的工業(yè)意義。 然而，為了考慮用于工業(yè)用途，SLs也必須廉價(jià)生產(chǎn)，并且必須了解和控制其物理性質(zhì)，以便準(zhǔn)確預(yù)測(cè)SLs在各種應(yīng)用中的潛力。 表面張力（ST）、臨界膠束濃度（CMC）、界面張力（IFT）和水溶性是表面活性劑應(yīng)用特別關(guān)注的四個(gè)性質(zhì)。 理想情況下，良好的表面活性劑是水溶性的，表現(xiàn)出較低的CMC，并導(dǎo)致最小表面張力（min.ST）小于30 mN/m。 這些性質(zhì)中的每一種都可以根據(jù)表面活性劑的化學(xué)組成進(jìn)行控制。 通過(guò)在多種不同的混合基質(zhì)（包括葡萄糖和4種不同的脂肪酸）上生長(zhǎng)棉鈴蟲(chóng)，我們產(chǎn)生了具有不同化學(xué)分布的SLs。 簡(jiǎn)單地通過(guò)改變脂肪酸來(lái)生產(chǎn)不同的SLs的能力提供了在發(fā)酵水平上管理物理性質(zhì)的前景，并通過(guò)在應(yīng)用水平上以不同的比例混合SLs。

SLs可以以相對(duì)大量的生物方式生產(chǎn)，并且大多數(shù)SLs以乳糖形式合成，側(cè)鏈主要從16到18個(gè)碳原子不等。 考慮到這一點(diǎn)，進(jìn)行了發(fā)酵，其中利用棉鈴蟲(chóng)從棕櫚酸（一種C16:0脂肪酸）和三種不同的C18脂肪酸[包括硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2）]合成SLs 希望由此產(chǎn)生的SLs的大部分側(cè)鏈能夠反映起始脂肪酸底物。 然后，通過(guò)混合各種SLs，可以實(shí)現(xiàn)性能控制，而無(wú)需進(jìn)行化學(xué)改性，這會(huì)增加分子的總體成本。 在所采用的發(fā)酵條件下，棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)并合成SLs，棕櫚酸產(chǎn)量為42 g/l，硬脂酸產(chǎn)量為77 g/l，油酸產(chǎn)量為98 g/l，亞油酸產(chǎn)量為40 g/l。 與棕櫚酸（SL-p）和亞油酸（SL-l）的SL產(chǎn)率相比，硬脂酸（SL-s）和油酸（SL-o）的SL產(chǎn)率增加，主要是由于酶對(duì)硬脂酸和油酸作為SL側(cè)鏈成分的偏好。 眾所周知，pH值影響酶的效率。 在所有四種SL發(fā)酵中，添加脂肪酸后的起始pH值為5.8±0.2，雖然在發(fā)酵過(guò)程中pH值未得到控制，但在細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)的24小時(shí)內(nèi)（接種后）對(duì)其進(jìn)行了監(jiān)測(cè)， 每次發(fā)酵的pH值降低至pH值2.5±0.5，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中保持不變。 在所有情況下，無(wú)論添加何種特定脂肪酸，發(fā)酵過(guò)程中的pH條件都是可比的； 因此，SL產(chǎn)量的差異似乎是酶底物特異性的結(jié)果，而不是pH值的差異。

圖2顯示了生產(chǎn)的4種SLs的總離子色譜圖（TIC）。 在每種情況下，主峰在15分鐘以上洗脫。SL-p和SL-l（圖2a，d）均顯示5個(gè)主峰，而SL-s和SL-o（圖2b，c）各只有3個(gè)主峰。

圖2葡萄糖和棕櫚酸（SL-p；a）、硬脂酸（SL-s；b）、油酸（SL-o；c）和亞油酸（SL-l；d）生產(chǎn)的槐脂產(chǎn)品的總離子色譜（TIC）曲線(xiàn)

在B和C中，在15和20分鐘之間沒(méi)有任何明顯的峰表明，在A(yíng)和D中在15和20分鐘之間洗脫的峰對(duì)應(yīng)于含有棕櫚酸和亞油酸的SLs，在21分鐘和25分鐘洗脫的峰分別對(duì)應(yīng)于含有油酸和硬脂酸的SLs。 大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜（APCI-MS）證實(shí)了這一點(diǎn)。 圖3顯示了TIC中每個(gè)基峰的APCI-MS。

在每個(gè)質(zhì)譜圖中，無(wú)論分子是什么，峰都顯示出相同的趨勢(shì)。 例如，每一個(gè)質(zhì)譜圖都顯示了一個(gè)對(duì)應(yīng)于質(zhì)子化分子離子（[M]+）的大的基峰。 根據(jù)SL側(cè)鏈中的長(zhǎng)度和不飽和度，該峰值在m/z 663（圖3a）到m/z 691（圖3b）、m/z 689（圖3c）和m/z 687（圖3d）之間變化。 在每種情況下，[M]+離子依次失去總共3個(gè)水分子，從而產(chǎn)生M/z值比之前離子少18個(gè)質(zhì)量單位的離子。 此外，每個(gè)[M]+損失了一個(gè)乙?；禾牵ㄙ|(zhì)量=204個(gè)單位），分別導(dǎo)致[M]+-204個(gè)M/z 459、M/z 487、M/z 485和M/z 483值（圖3a至d），另外損失了2個(gè)水分子。 最后，圖3a至d中m/z 273、m/z 301、m/z 299和m/z 297處的離子分別對(duì)應(yīng)于與每個(gè)SL分子相關(guān)聯(lián)的質(zhì)子化羥基脂肪酸（[FA（OH）]+）。 通過(guò)使用與每個(gè)峰相關(guān)的值，可以識(shí)別TIC中的每個(gè)峰，并量化每個(gè)SL分子的絕對(duì)分布。 正如所希望的那樣，每個(gè)脂肪酸底物產(chǎn)生大量的SL分子，其中包含作為側(cè)鏈成分的特定脂肪酸。 明確了對(duì)硬脂酸和油酸的偏好，因?yàn)榧词故褂米貦八岷蛠営退嶙鳛榈孜?，這兩種脂肪酸在SL側(cè)鏈中也以可測(cè)量的數(shù)量存在。 這些結(jié)果表明，在形成SL分子之前，棉鈴蟲(chóng)將至少部分底物脂肪酸酶轉(zhuǎn)化為硬脂酸或油酸。 相比之下，SL-s和SL-o的TIC色譜圖在15到20分鐘之間缺少峰值，這表明在SL合成之前很少發(fā)生棕櫚酸或亞油酸的轉(zhuǎn)化，從而證明了在SL合成中酶對(duì)硬脂酸和油酸的偏好，并進(jìn)一步解釋了SL-s和SL-o產(chǎn)量增加的原因。

圖3正大氣壓化學(xué)電離（APCI）-來(lái)自圖2中每個(gè)TIC色譜圖基峰的質(zhì)譜圖。 圖2的TIC中的C16:0二乙?；敝瑑?nèi)酯（RT=16.7分鐘）、圖2的TIC中的C18:0二乙酰化槐脂內(nèi)酯（RT=25.2分鐘）、圖2c的TIC中的C18:1二乙酰化槐脂內(nèi)酯（RT=20.7分鐘）和圖2d的TIC中的C18:2二乙?；敝瑑?nèi)酯（RT=15.8）。 （[M]+=質(zhì)子化分子離子；[M]+-204=質(zhì)子化分子離子-減去乙?；禾牵ㄙ|(zhì)量204）；[FA（OH）]+=質(zhì)子化羥基脂肪酸）

TIC（圖2）中對(duì)應(yīng)于含有棕櫚酸、硬脂酸和油酸的SLs的峰均顯示具有相同質(zhì)譜的第二個(gè)峰。 根據(jù)之前報(bào)告的數(shù)據(jù)（Nun?ez et al.2001），我們得出結(jié)論，在這兩個(gè)峰中，首先洗脫的峰對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)變化，槐糖環(huán)的10-羥基和脂肪酸的x-1碳之間存在糖苷鍵，而隨后的洗脫峰（通常是除SL-p外的一個(gè)次要峰） 通過(guò)糖環(huán)與脂肪酸的x碳之間的糖苷鍵連接。 根據(jù)APCI-MS結(jié)果，確定在每種情況下，無(wú)論底物如何，超過(guò)92%的SL分子為內(nèi)酯構(gòu)象（表1）。

表1：通過(guò)LC/APCI MSa測(cè)定的由C.bombicola從棕櫚酸（SL-p）、硬脂酸（SL-s）、油酸（SL-o）、亞油酸（SL-l）酸生產(chǎn)的槐脂的結(jié)構(gòu)含量（開(kāi)鏈與內(nèi)酯）

無(wú)論乙酸乙酯萃取時(shí)間長(zhǎng)短，情況都是如此。 我們的方案包括三次單獨(dú)提取，每次提取兩天。 選擇這些時(shí)間是為了最大限度地提高溶解度，從而提高SL回收率。 然而，通過(guò)檢查作為時(shí)間函數(shù)的優(yōu)先溶解度，確定TLC板上形成的斑點(diǎn)數(shù)量與每個(gè)SL樣品（見(jiàn)圖2）的TIC中存在的化合物數(shù)量相對(duì)應(yīng)，這些化合物通過(guò)APCI-MS鑒定為二乙?；瘍?nèi)酯（見(jiàn)圖3）。 表2顯示了每個(gè)SLs的絕對(duì)分布，包括x與x-1連桿的比率（如可能）。

表2：根據(jù)羥基脂肪酸含量，由C.bombicola從棕櫚酸（SL-p）、硬脂酸（SL-s）、油酸（SL-o）、亞油酸（SL-l）及其混合物中生產(chǎn)的槐脂的二乙酰化內(nèi)酯分布

在4個(gè)SL中，只有一個(gè)SL-p的x-連桿總數(shù)大于x-1-連桿。 具體而言，在75%的棕櫚酸殘基中，39%通過(guò)x位置連接，36%通過(guò)x-1位置連接。 在其他情況下，大部分（至少71%）的脂肪酸通過(guò)x-1位置結(jié)合（亞油酸在所用LC方法下不可溶解，因此被報(bào)告為x和x-1組合結(jié)構(gòu)）。 這些結(jié)果表明，為了形成內(nèi)酯，糖苷鍵和酯鍵之間必須至少有15個(gè)甚至17個(gè)碳單元。 SL-o和SL-s中對(duì)x-1連接的極大偏好表明17個(gè)碳是內(nèi)酯形成的首選碳。 然而，通過(guò)將棕櫚酸連接到x碳處的SL，鏈長(zhǎng)度增加了1個(gè)碳單元（鍵間16個(gè)碳），使得內(nèi)酯的形成比連接到x-1碳（鍵間15個(gè)碳）時(shí)更有利。 SL-p中存在C17:0脂肪酸含量較低（3%）的SLs進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，而SL-s、SL-o和SL-l中沒(méi)有C17:0脂肪酸夾雜的跡象。 根據(jù)這些數(shù)據(jù)和二乙?；瘍?nèi)酯分布（見(jiàn)表2），得出結(jié)論，對(duì)于SL包裹體測(cè)試的單個(gè)脂肪酸，其優(yōu)先順序?yàn)橛退?、硬脂酸、棕櫚酸和亞油酸，以及C18脂肪酸， 單原子飽和優(yōu)于飽和和雙不飽和。

測(cè)試表面活性性質(zhì)，以確定每種SL對(duì)水溶性、最小ST、CMC和IFT的影響。 我們發(fā)現(xiàn)SL-p和SL-l的水溶性均大于200mg/l，而SL-s和SL-o的水溶性均小于200mg/l。 圖4顯示了SL濃度對(duì)水表面張力的影響（圖4a）和流速對(duì)IFT的影響（圖4b）。

圖4槐脂濃度和流速對(duì)水溶液中的表面張力（a）和界面張力（b）的影響，包括來(lái)自葡萄糖和棕櫚酸（SL-p；d）、硬脂酸（SL-s；s）、油酸（SL-o；）和亞油酸（SL-l；r）的槐脂。

槐糖脂的屬性：脂肪酸底物和混合比例的影響——摘要、介紹

槐糖脂的屬性：脂肪酸底物和混合比例的影響——材料和方法

槐糖脂的屬性：脂肪酸底物和混合比例的影響——結(jié)果與討論

槐糖脂的屬性：脂肪酸底物和混合比例的影響——結(jié)論、致謝！